Учурдагы†Учурдагы дареги: OX11 0DE, Улуу Британия, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Оксфордшир, Улуу Британия, Diamond Light Source Co., Ltd., Электрондук биологиялык сүрөт тартуу борбору.
Реакция борборунун жарык чогултуучу комплекси 1 (RC-LH1) кочкул кызыл фототрофтук бактериялардын негизги фотосинтетикалык компоненти болуп саналат. Биз Rhodopseudomonas palustrisтен алынган RC-LH1 комплексинин эки криоэлектрондук микроскопиялык түзүлүшүн киргиздик. RC-LH114-W комплексинин 2,65-Å чечилиш түзүлүшү RCди курчап турган 14 LH1 суббирдигинен турат, ал W протеини менен үзгүлтүккө учурайт, ал эми W протеини жок комплекс толугу менен RC менен курчалган RC курамынан турат. LH1 илмеги жабык 16 суббирдиги. Бул түзүлүштөрдү салыштыруу RC-LH1 комплексиндеги хинондун динамикасы, анын ичинде RC QB сайтында хинонду байланыштырганда мурда аныкталбаган конформациялык өзгөрүүлөр, ошондой эле аларды RCге өткөрүүгө жардам берген жардамчы хинон байланыштыруучу жерлердин жайгашкан жери жөнүндө түшүнүк берет. W протеининин уникалдуу түзүлүшү LH1 илмегинин жабылышына жол бербейт, ошону менен хинон/хинолон алмашуусун тездетүү үчүн канал түзөт.
Фотосинтез тарабынан берилген энергия жер жүзүндөгү дээрлик бардык жашоону камсыздай алат жана күн биотехнологиясы үчүн чоң потенциалга ээ. Дүйнөлүк фотосинтезди өнүктүрүү менен бирге, кочкул кызыл фототрофтук бактериялар ар кандай энергия режимдерин жана зат алмашуу мүмкүнчүлүктөрүн да көрсөтүшөт. Алар фотосинтезден кача алышат жана караңгыда гетеротрофтук бактериялар катары өсө алышат, азот менен көмүр кычкыл газын фиксациялай алышат, суутекти өндүрө алышат жана ароматтык кошулмаларды ажырата алышат (1-3). Бул процесстер үчүн энергия менен камсыз кылуу үчүн жарык тез жана натыйжалуу химиялык энергияга айландырылышы керек. Бул процесс жарыкты кармоочу антенна комплекси жарыкты сиңирип, кармалган энергияны реакция борборуна (RC) өткөрүп бергенде башталат, ошону менен заряддын бөлүнүшү башталат (4-7). Кочкул кызыл фототрофтук бактериялардагы фотосинтездин негизги бирдиги 2-типтеги RCден турат, ал жарык чогултуучу 1-комплекс (LH1) менен курчалган жана RC-LH1 өзөктүк комплексин түзөт. LH1 ар бири эки бактериялык хлорофиллдин (BChl) a молекуласын жана бир же эки каротиноидди (8-12) байланыштырган ийри αβ гетеродимерлердин массиви менен пайда болот. Эң жөнөкөй LH1 антеннасы RC (9-13) жабык циклде айланасындагы 16 же 17 αβ гетеродимерлерден турат, бирок башка өзөктүк комплекстерде трансмембраналык пептиддер айланасындагы LH1дин үзгүлтүксүздүгүн үзгүлтүккө учуратат, ошону менен RC менен цитохром bc1 комплексинин ортосундагы хинол/хинон диффузиясын күчөтөт (11, 13-15). Кочкул кызыл фототрофтук өсүмдүк Rhodopseudomonas (Rps.) - фотосинтезди колдогон энергияны жана электрондордун өтүшүн түшүнө алган модель организм. Rpsтин биринчи кристаллдык түзүлүшү. Palustris RC-LH1 комплексинин модели RC болуп саналат, ал 15 гетеродимердик LH1 цикли менен курчалган, алар "Protein W" деп аталган белгисиз белок менен үзгүлтүккө учурайт (14). Кийинчерээк Protein-W RPA4402 катары аныкталган, ал үч болжолдонгон трансмембраналык спиральдары (TMH) бар мүнөздөлбөгөн 10,5 кДа белок (16). Биз W белокту коддогон rpa4402 генин RC-L, M (pufL, pufM) жана LH1α, β (pufA, pufB) суббирдиктерин коддогон гендер үчүн колдонулган номенклатурага шайкеш келүү үчүн pufW деп атоону сунуштайбыз. Кызыктуусу, W белок RC-LH1дин болжол менен 10% гана бар, бул Rps. palustris эки башка RC-LH1 комплекстерин өндүрөрүн көрсөтөт. Бул жерде биз эки өзөктүк комплекстин жогорку чечилиштеги крио-ЭМ (крио-ЭМ) структураларын келтиребиз, бири W белок жана 14 αβ гетеродимерлери менен, экинчиси W белоксуз жана жабык 16 гетеродимер LH1 цикли менен. Биздин структура Rps. palustrisтин RC-LH1 комплексин түшүнүүдөгү этаптык өзгөрүүнү билдирет, анткени биз ар бир варианттын бир тектүү популяциясын талдап чыктык жана ар бир пептидди жана байланышкан пигменттерди жана тиешелүү липиддерди жана хинондорду так дайындоо үчүн жетиштүү чечилишке ээбиз. Бул структураларды салыштыруу көрсөткөндөй, азырынча башка RC-LH1 комплексинде кездешпеген үч TMH белоктору-W хинон/хинолон алмашуусун тездетүү үчүн хинон каналын түзөт. Бир катар сакталган липиддик жана хинон байланыштыруучу жерлер аныкталды жана биз хинон менен RC айкалышынан кийин жаңы конформациялык өзгөрүүнү аныктадык, бул кычкылтек менен байытылган фототрофтук организмдердин фотосистема II (PSII) RC үчүн ылайыктуу болушу мүмкүн. Биздин ачылыштар кочкул кызыл фототрофтук бактериялардын RC-LH1 өзөктүк комплексиндеги хинон/хинолон байланышынын жана алмашуусунун кинетикасы жөнүндө жаңы түшүнүктөрдү берет.
Rps. palustrisте табылган эки комплексти деталдуу изилдөөнү жеңилдетүү үчүн, биз ар бир RC-LH1ди биохимиялык ыкмалар менен бөлүп алдык. Белоктун жетишсиздиги бар W комплекси (мындан ары ΔpufW деп аталат) pufW гени жок штаммдан тазаланган (16) жана бир гана RC-LH1 комплексин өндүрүүгө болот. Белокту камтыган W комплекси штамм тарабынан өндүрүлөт. Бул штаммдын W протеини C-терминалында 10x His теги менен модификацияланган, ошондуктан W протеин камтыган комплекс металлды иммобилизациялоо аркылуу көпчүлүк жетишсиз W протеини менен натыйжалуу айкалыштырылышы мүмкүн. Комплекс натыйжалуу бөлүнгөн (16) Аффиндик хроматография (IMAC).
1-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, эки комплекс тең LH1 антеннасы менен курчалган үч суббирдик RC (RC-L, RC-M жана RC-H) камтыйт. Белок-W жок комплекстин 2.80-A түзүлүшүндө 16 αβ гетеродимерлери бар, алар RCди толугу менен курчап турган жабык LH1 илмегин түзөт, андан ары RC-LH116 комплекси деп аталат. Белок-W камтыган комплекстин 2.65Å түзүлүшүндө белок-W менен үзгүлтүккө учураган 14-гетеродимер LH1 бар, андан ары RC-LH114-W деп аталат.
(A жана B) Кошулманын беттик көрүнүшү. (C жана D) Таякчаларда көрсөтүлгөн байланыш пигменттери. (E жана F) Цитоплазмалык беттен байкалган комплекстер мультфильмдерде көрсөтүлгөн пептиддерге жана LH1 суббирдиктерине ээ жана белок-W аралыгынан саат жебеси боюнча номерленет [Rba номерлөөсүнө ылайык келет. сфероиддер комплекси (13)]. LH1-α үчүн белок суббирдигинин түсү сары; LH1-β үчүн белок суббирдигинин түсү көк; белок-W үчүн белок кызыл; RC-H үчүн көгүлтүр; RC-L үчүн кызгылт сары; RC-M үчүн кызгылт көк. Кофакторлор таякчалар менен, жашыл BChl жана BPh a молекулаларын, кызгылт көк каротиноиддерди, ал эми сары UQ10 молекулаларын билдирет. (G жана H) RC-LH114-W комплексинин (G) жана RC-LH116 комплексинин (H) эквиваленттүү аймагындагы белок-W аралыгынын чоңойтулган көрүнүшү. Кофакторлор мейкиндикти толтуруу түрүндө көрсөтүлөт, хелатталган хинон көк түстө көрсөтүлөт. Белок-W аралыгы (G) сызыгында көк түстөгү үзүк сызык менен белгиленген, ал эми хинон/хинолол LH116 шакекчесинде диффузияланган кичинекей тешиктер (H) сызыгында кара үзүк сызык менен белгиленген.
1-сүрөттө (А жана В) LH1αβ гетеродимерлеринин ачык же жабык массивдери менен курчалган RC көрсөтүлгөн, алардын ар бири эки BChl жана бир каротиноид менен байланышат (1-сүрөт, С жана D). Мурунку изилдөөлөр Rps LH1 комплекси экенин көрсөттү. Спирулина ксантининин биосинтетикалык жолунда бул түрлөрдө каротиноиддердин аралаш популяциялары бар (17). Бирок, спиропирроксантин доминанттык каротиноид болуп саналат жана анын тыгыздыгы канааттандырарлык. Ошондуктан, биз спироксантинди бардык LH1 байланыш жерлеринде моделдөөнү чечтик. Альфа жана бета полипептиддер кыска мембраналуу сырткы аймактары бар бир TMH болуп саналат (1-сүрөт, А, В, Е жана F). С-терминалындагы 17 калдыктын тыгыздыгы байкалбаса да, альфа полипептид эки комплексте тең Met1ден Ala46га чейин бөлүнгөн. RC-LH116да β полипептиди Gly4төн Tyr52ге, ал эми RC-LH114-Wда Ser5тен Tyr52ге чейин калыбына келген. 3 же 4 N-терминалдык же 13 C-терминалдык калдыктарынын тыгыздыгы байкалган эмес (S1-сүрөт). Жапайы типтеги штаммдан даярдалган аралаш RC-LH1 комплексинин массалык-спектрометриялык анализи жоголгон аймак бул пептиддердин гетерологиялык бөлүнүшүнүн натыйжасы экенин көрсөттү (S1 жана S2-сүрөттөр). α-Met1дин N-терминалдык формилдешүүсү да байкалган (f). Анализ көрсөткөндөй, α-пептид fMet1ден Asp42/Ala46/Ala47/Ala50гө чейинки калдыктардан турат, ал эми β-пептид Ser2ден Ala53кө чейинки калдыктардан турат, бул төмөнкү температурадагы ЭМ тыгыздык картасына жакшы дал келет.
α-His29 жана β-His36 координациясы BChlsти бетме-бет кылат; ар бир αβ гетеродимери кошуналары менен чогулуп, RC экситон менен байланышкан пигмент массивинин айланасында ачык цикл (RC-LH114-W) же жабык цикл (RC-LH116) түзөт (1-сүрөт, C жана D). RC-LH114-Wнин 877 нм тилкеси менен салыштырганда, RC-LH116нын 880 нм сиңирүү кызыл жылышы 3 нмди түзөт (2A-сүрөт). Бирок, тегерек дихроизм спектри дээрлик бирдей (2B-сүрөт), бул ачык жана жабык циклдердин ортосунда ачык айырмачылык болгону менен, BChlsтин жергиликтүү чөйрөсү абдан окшош экенин көрсөтүп турат. Абсорбциянын кызыл жылышы жабык циклдеги жылуулук кыймылынын азайышынын жана туруктуулуктун жогорулашынын (18, 19), жабык циклден улам пайда болгон пигмент байланышынын өзгөрүшүнүн (20, 21) же бул эки эффекттин айкалышынын (11) натыйжасы болушу мүмкүн.
(A) Ультрафиолет/көрүнүүчү/жакын инфракызыл сиңирүү спектри, анын чокулары тиешелүү пигменттер менен белгиленип, 775 нмдеги BPh чокусуна чейин нормалдаштырылган. (B) 805 нмдеги BChl сиңирүүсүнө чейин нормалдаштырылган тегерек дихроизм спектри. (C жана D) RC-LH114-W комплексинин (C) жана RC-LH116 комплексинин (D) убакыт боюнча чечилген сиңирүү спектрлеринен тандалган ΔA спектрлери. Жакшыраак салыштыруу үчүн, бардык спектрлер 0,2 псде −Aнын ∆Aсына чейин нормалдаштырылган. (E) UQ2нин ар кандай концентрацияларынын катышуусунда нурлантуудан кийинки цитохром c2 кычкылдануу ылдамдыгы (чийки маалыматтар үчүн S8-сүрөттү караңыз). (F) Төмөн, орто же жогорку интенсивдүү жарыктын астында өстүрүлгөн клеткаларда (тиешелүүлүгүнө жараша 10, 30 же 300μMm-2 s-1), тазаланган комплекстеги W жана RC-L суббирдиктери жана бөлүнгөн мембрана катышы. Белоктун деңгээлин SDS-полиакриламид гелинин электрофорези жана иммуноанализи аркылуу аныктаңыз (чийки маалыматтар үчүн S9-сүрөттү караңыз). Тазаланган RC-LH114-W комплексине карата катышын аныктаңыз. Комплекстин RC-L жана белок-W стехиометриялык катышы 1:1.
RC-LH114-W деформацияланган αβ14 циклиндеги 1-позициядагы BChl'дер (1-сүрөт, A, C жана E) RC баштапкы доноруна (P) RC-LH116дагы эквиваленттүү BChl'дерге караганда 6,8Å жакыныраак (1-сүрөт, B, D жана F, жана S3-сүрөт); бирок, эки комплекстин өткөөл сиңирүү кинетикасы RC-LH114-W жана RC-LH116 үчүн LH1ден RCге дүүлүктүрүү энергиясынын өтүү убактысынын константалары 40 ±4 жана 44±3 ps экенин көрсөтүп турат (2-сүрөт). , C жана D, S4-сүрөт жана S2-таблица). RC ичинде электрондук өтүүдө да олуттуу айырмачылык жок (S5-сүрөт жана тиешелүү кошумча текст). LH1 жана RC-P ортосундагы энергия өтүү убактысынын жакын дал келиши эки LH1 циклиндеги көпчүлүк BChl'дердин окшош аралыгына, бурчуна жана потенциалдык энергиясына байланыштуу деп шектенебиз. Минималдуу аралыкка жетүү үчүн LH1 энергия схемасын изилдөө энергияны субоптималдуу жерлерден RCге түз өткөрүп берүүдөн тезирээк эмес окшойт. RC-LH114-Wдеги ачык циклдеги LH1 цикли структуралык анализ үчүн төмөнкү температура шарттарында анча чоң эмес жылуулук кыймылына дуушар болушу мүмкүн жана бөлмө температурасында RC 1 позициясындагы βBChls пигментациясынын аралыгынан узунураак αβ14 шакекче конформациясы бар.
RC-LH116 комплекси 32 BChl жана 16 каротиноидди камтыйт жана анын жалпы жайгашуусу Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Белок маалыматтар банкы (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 штаммынан (PDB ID 7C9R) (12) жана жашыл балырлардан (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10) алынган жайгашуу менен бирдей. Тегизделгенден кийин, αβ гетеродимерлеринин абалында, айрыкча 1-5, 15 жана 16да, кичинекей четтөөлөр гана байкалган (S6-сүрөт). Белок-Wнин болушу LH1дин түзүлүшүнө олуттуу таасир этет. Анын үч TMH кыска илмек менен байланышкан, N-терминалы комплекстин люмен тарабында, ал эми C-терминалы цитоплазмалык тарабында (1A жана 3-сүрөттөр, A дан D га чейин). Протеин-W көбүнчө гидрофобдук (3B-сүрөт), ал эми TMH2 жана TMH3 LH1αβ-14 менен өз ара аракеттенишип, трансмембраналык бетти түзөт (3-сүрөт, B жана Eден Gге чейин). Интерфейс негизинен трансмембраналык аймактагы Phe, Leu жана Val калдыктарынан турат. Бул калдыктар гидрофобдук аминокислоталар жана αβ-14 пигменттери менен катмарланган. Айрым полярдык калдыктар да өз ара аракеттенүүгө салым кошот, анын ичинде комплекс көңдөйүнүн бетиндеги W-Thr68 жана β-Trp42 ортосундагы суутек байланышы (3-сүрөт, F жана G). Цитоплазманын бетинде Gln34 αβ-14 каротиноиддеринин кето тобуна жанаша жайгашкан. Мындан тышкары, n-додецил β-d-мальтозид (β-DDM) молекуласы чечилип, анын гидрофобдук куйругу протеин-W менен αβ-14 ортосундагы интерфейске чейин созулган жана липиддик куйрук денеде жайгашышы мүмкүн. Ошондой эле, W жана RCH белокторунун С-терминалдык чечилиш аймактары абдан жакын экенин, бирок белгилүү бир өз ара аракеттенүүлөрдү түзүү чөйрөсүнө кирбей турганын байкадык (1-сүрөт, А жана Е). Бирок, бул эки белоктун чечилбеген С-терминалдык аминокислоталарында өз ара аракеттенүүлөр болушу мүмкүн, бул RC-LH114-W комплексин чогултуу учурунда белок-Wди тартуу механизмин камсыз кылышы мүмкүн.
(A) LH1αβ14 менен мультфильм түрүндөгү чекитке караган Protein-W электростатикалык потенциал диаграммасынын бир бөлүгүндө көрсөтүлгөн таякча сымал каптал чынжырына (кызыл) ээ (контур деңгээли 0,13 болгон тунук боз бет). (B) Protein-W гидрофобдук түстүү бет менен көрсөтүлгөн. Полярдык жана заряддалган аймактар ​​көгүлтүр түстө, гидрофобдук аймактар ​​ак түстө, ал эми күчтүү гидрофобдук аймактар ​​кызгылт сары түстө көрсөтүлгөн. (C жана D) Protein-W мультфильмде көрсөтүлгөн, анын багыты (A) (C) менен бирдей жана 180° (D) бурулган. Тизмедеги позицияга ылайык, айырмалануучу калдыктар асан-үсөн түс схемасын кабыл алат, мында N-учу көк, ал эми C-учу кызыл. (E) Protein-W (A) менен бирдей көрүнүштө жана Protein-W:LH1 чекитиндеги калдыктар бекитилген белгилери бар таякчалар менен көрсөтүлгөн. (F) Протеин-W мультфильмдеги сүрөттө (E) жана LH1αβ14кө карата 90°, ал эми тилкедеги сүрөттө интерфейс калдыктарына карата 90° бурулган. Бета полипептидден илинип турган калдыктар белгиленген. Кофактор 1-сүрөттөгү түскө дал келген тилке катары көрсөтүлгөн, ажыроочу β-DDM боз түстө, ал эми кычкылтек кызыл түстө көрсөтүлгөн. (G) (F)деги көрүнүш белгиленген альфа полипептидинин көрүнүктүү калдыктары менен 180° бурулган.
Protein-W αβ гетеродимерин (1F сүрөттөгү 15-чи) алмаштырат, ошону менен илмектин жабылышына жол бербейт жана алгачкы үч αβ гетеродимерин кыйшайт. Биринчи αβ-1 гетеродимеринин пленканын нормалына карата максималдуу жантайуу бурчу 25°тан 29°ка чейин экени байкалган (1-сүрөт, A жана E), ал RC A кескин контрастындагы-LH116дагы αβ-1дин 2°тан 8°ка чейин жантайышы менен пайда болгон (1-сүрөт, B жана F). Экинчи жана үчүнчү гетеродимерлер тиешелүүлүгүнө жараша 12°тан 22°ка чейин жана 5°тан 10°ка чейин жантайышат. RCтин стерикалык тоскоолдуктарынан улам, αβ-1дин жантайышы αβтин экинчи жубун камтыбайт (ал 1F сүрөттөгү 16-αβга туура келет), ошону менен LH1 шакекчесинде ачык боштукту пайда кылат (1-сүрөт, A жана E). Эки αβ гетеродимеринин жоктугунан, төрт BChl жана эки каротиноиддин жоголушунан улам, каротиноиддердин бири да буралган αβ-1 суббирдигине байланбайт, натыйжада 13 Vegetarian жана 28 BChl каротиноидин камтыган LH114-W шакекчеси пайда болот. αβ1ден 7ге чейинки аймактардагы эки комплекстин жергиликтүү чечилиш баалары LH1 циклинин калган бөлүгүнө караганда төмөн, бул RC QB сайтына жанаша жайгашкан LH1 суббирдигинин ички пластикалуулугун чагылдырышы мүмкүн (4-сүрөт).
RC-LH114-W (A жана B) жана RC-LH116 (C жана D) сүрөттөрү 1-сүрөттөгү (B жана D) бир эле үстүнкү көрүнүштөн/каптал көрүнүшүнөн (A жана B) (A жана C) жана көңдөй бетинен көрсөтүлгөн. Түстүү баскычтар оң жакта көрсөтүлгөн.
Стехиометриялык катышы 1:14 болгон жалгыз мүнөздүү өзөктүк комплекс - бул Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димери (13). Бирок, W жана PufX белокторунун гомологиясы ачык эмес жана алардын тиешелүү LH1 структураларына олуттуу таасир этет. PufX - бул RC-H суббирдигинин (13) цитоплазмалык тарабы менен Rps. palustris LH116αβ-16га туура келген абалда өз ара аракеттенген N-терминалдык цитоплазмалык домени бар бирдиктүү TMH. PufX RC-LH1 менен цитохром bcl комплексинин ортосундагы хинон/хинолон алмашуусу үчүн канал түзөт жана бардык Rba. sphaeroides өзөктүк комплексинде бар (13). Мономер-мономер интерфейси Rbaда болсо да. RC-LH1-PufX димеринин сфероиддери RC-LH114-Wдеги W белоктун байланышуу абалында жайгашкан жана PufX жана W белоктору тарабынан индукцияланган боштук эквиваленттүү абалда (S7A-сүрөт). RC-LH114-Wдеги боштук ошондой эле Pseudomonas rosea LH1 гипотетикалык хинон каналы (8) менен дал келет, ал W же PufX белоктору менен байланышы жок пептиддерден пайда болот (S7B-сүрөт). Мындан тышкары, Blcдеги хинон каналы. Бир γ суббирдигин (7) алып салуу менен пайда болгон изумруд жашыл LH1 окшош абалда жайгашкан (S7C-сүрөт). Ар кандай белоктор аркылуу ишке ашса да, бул хинон/хинолол каналдарынын RC-LH1 комплексинде жалпы абалда пайда болушу конвергенттик эволюциянын мисалы болуп көрүнөт, бул W белоктору тарабынан түзүлгөн боштук хинон каналы катары кызмат кылышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
LH114-W циклиндеги боштук белоктордогудай белок тешикчеси аркылуу эки доменди туташтыруунун ордуна, RC-LH114-W комплексинин ички мейкиндиги менен көлөмдүк мембрананын ортосунда үзгүлтүксүз мембрана аймагын түзүүгө мүмкүндүк берет (1G-сүрөт). RC-LH116 комплекси жабык Tch. Ийне сымал комплекске окшош (22) (1H-сүрөт). Хинондун мембрана аркылуу диффузиясы тар белок каналы аркылуу диффузияга караганда тезирээк болгондуктан, ачык LH114-W цикли жабык LH116 циклине караганда RC алмашуусун тездете алат жана хинондун RCге диффузиясы чектелүү болушу мүмкүн. W белок хинондордун RC аркылуу конверсиясына таасир этеби же жокпу, текшерүү үчүн, биз убихинон 2нин (UQ2) белгилүү бир концентрациясында (изопрен куйругу кыскараак болгон табигый UQ10 аналогу) цитохром кычкылдануу анализин жүргүздүк (2E-сүрөт). Хелатталган хинондун болушу Михаэлис константасын так аныктоого тоскоол болсо да (RC-LH114-W жана RC-LH116 тиешелүүлүгүнө жараша 0,2±0,1μM жана 0,5±0,2μM үчүн ылайыктуу), RC-LH114-W максималдуу ылдамдыгы (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) RC-LH116га караганда (3,6±0,1 e-RC-1 s-1) 28±5% чоң.
Башында биз протеин-W өзөктүк комплекстин болжол менен 10%ында бар экенин эсептегенбиз (16); бул жерде аз жарыктагы, орточо жарыктагы жана көп жарыктагы өсүү клеткаларынын толтуруу көрсөткүчтөрү тиешелүү түрдө 15±0,6%, 11±1% жана 0,9±0,5% түзөт (2F-сүрөт). Массалык спектрометриянын сандык салыштыруусу гистидин тегин кошуу жапайы типтеги штаммдарга салыштырмалуу протеин-W салыштырмалуу көптүгүн азайтпаганын көрсөттү (P = 0,59), андыктан бул деңгээлдер модификацияланган протеин-W артефакты эмес (S10-сүрөт). Бирок, RC-LH1 комплексиндеги протеин-Wнын мындай аз толтурулушу кээ бир RCлердин тездетилген ылдамдыкта айлануусуна мүмкүндүк берет, ошону менен RC-LH116 комплексиндеги хинон/хинолон алмашуусунун жайлашын азайтат. Биз жогорку жарыктагы толтуруу көрсөткүчү акыркы транскриптомика маалыматтарына дал келбей турганын байкадык, бул күчтүү жарыкта pufW генинин экспрессиясы жогорулай турганын көрсөтүп турат (S11-сүрөт) (23). pufW транскрипциясы менен белок-Wнин RC-LH1 комплексине кошулушунун ортосундагы айырмачылык түшүнүксүз жана белоктун комплекстүү жөнгө салынышын чагылдырышы мүмкүн.
RC-LH114-Wде 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерин (POPG) жана 29 β-DDM молекулалары бөлүнүп, анда 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG жана 12 βDDM моделденген. RC-LH116 (5-сүрөт, А жана В). Бул эки структурада CDL комплекстин цитоплазмалык тарабында дээрлик жайгашкан, ал эми POPC, POPG жана β-DDM көбүнчө люминалдык тарабында жайгашкан. RC-LH114-W комплексинин αβ-1ден αβ-6га чейинки аймагында эки липиддик жана жуугуч молекула бөлүнүп алынган (5А-сүрөт), ал эми бешөө RC-LH116нын эквиваленттүү аймагында бөлүнүп алынган (5B-сүрөт). Комплекстин экинчи тарабында, негизинен CDLде, RC менен αβ-7ден αβ-13кө чейин топтолгон көбүрөөк липиддер табылган (5-сүрөт, А жана В). Башка структуралык жактан чечилген липиддер жана жуучу каражаттар LH1 шакекчесинин сыртында жайгашкан, ал эми жакшы чечилген ацил чынжырлар LH1 суббирдиктеринин ортосунда созулат, RC-LH114-Wде болжол менен β-DDM катары белгиленет жана β-DDM жана POPC-LH116 аралашмасындагы RC Aда β-DDM катары аныкталат. Биздин түзүлүштөгү хелаттоочу липиддердин жана жуучу каражаттардын окшош позициялары алардын физиологиялык жактан маанилүү байланыш жерлери экенин көрсөтүп турат (S12A-сүрөт). Tchдеги эквиваленттүү молекулалардын позициялары да жакшы консистенцияга ээ. Gentle жана Trv. 970 RC-LH1s штаммы (S12-сүрөт, B дан E га чейин) (9, 12) жана липиддик баш тобунун суутек байланыштарынын калдыктары ырааттуулукту тууралоодо жакшы сакталгандыгын көрсөттү (S13-сүрөт), бул RC менен байланышкан CDL сакталганда (24), бул жерлер RC-LH1 комплексинде сакталышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
(A жана B) RC-LH114-W (A) жана RC-LH116 (B) пептиддери 1-сүрөттөгү түс схемасын колдонуп, мультфильмдер менен, ал эми пигменттер таякчалар менен көрсөтүлгөн. Липиддер кызыл түстө, ал эми жуучу каражаттар боз түстө көрсөтүлгөн. RC QA жана QB жерлерине байланышкан UQ сары түстө, ал эми обочолонгон UQ көк түстө. (C жана D) (A) жана (B) менен бирдей көрүнүштөр, липиддер алынып салынган. (Eден Gге чейин) RC-LH116дан алынган Q1(E), Q2(F) жана Q3(G) чоңойтулган көрүнүшү, бири-бирине таасир этүүчү каптал чынжырлар менен. Суутек байланыштары кара үзүк сызыктар катары көрсөтүлгөн.
RC-LH116да зарядды бөлүү процессинде электрондордун өткөрүлүшүнө катышкан RC QA жана QB UQ экөө тең байланыш жерлеринде ажырайт. Бирок, RC-LH114-Wде QB хинон чечиле элек жана төмөндө кененирээк талкууланат. QA жана QB хинондорунан тышкары, RC-LH114-W түзүлүшүндө эки хелатталган UQ молекуласы (RC жана LH1 шакекчелеринин ортосунда жайгашкан) жакшы чечилген баш топторуна (тиешелүүлүгүнө жараша Q1 жана Q2де жайгашкан) ылайык бөлүштүрүлгөн. мейкиндик). 5C-сүрөт). Q1ге эки изопрен бирдиги дайындалган жана тыгыздык картасы Q2нин толук 10 изопрен куйругун аныктайт. RC-LH116 түзүлүшүндө үч хелатталган UQ10 молекуласы (Q1ден Q3кө чейин, 5D-сүрөт) чечилген жана бардык молекулалардын куйрук боюнча так тыгыздыгы бар (5-сүрөт, Dден Gге чейин). Эки структурада Q1 жана Q2 хинон баш топторунун абалы эң сонун консистенцияга ээ (S12F сүрөтү) жана алар RC менен гана өз ара аракеттенишет. Q1 RC-LH114-W W аралыгынын кире беришинде жайгашкан (1G жана 5-сүрөттөр, C, D жана E), ал эми Q2 QB байланышуу жеринин жанында жайгашкан (5-сүрөт, C, D) жана F). Консервацияланган L-Trp143 жана L-Trp269 калдыктары Q1 жана Q2ге абдан жакын жана потенциалдуу π-стекинг өз ара аракеттенүүлөрүн камсыз кылат (5-сүрөт, E жана F, жана S12-сүрөт). Q1дин дисталдык кычкылтекинен 3,0 Å бөлүнгөн L-Gln88 күчтүү суутек байланышын камсыз кылат (5E сүрөтү); бул калдык эң алыскы байланыштан башка бардык RCлерде сакталат (S13-сүрөт). L-Ser91 көпчүлүк башка RCлерде Thr менен консервативдүү түрдө алмаштырылат (S13-сүрөт), Q1 метил кычкылтекинен 3,8 ангстремди түзөт жана алсыз суутек байланыштарын камсыз кылышы мүмкүн (5E-сүрөт). Q3 белгилүү бир өз ара аракеттенүүгө ээ эмес окшойт, бирок RC-M суббирдиги менен LH1-α 5тен 6га чейинки суббирдигинин ортосундагы гидрофобдук аймакта жайгашкан (5-сүрөт, D жана G). Q1, Q2 жана Q3 же жакын жердеги хелатталган хинондор Tch. Gentle, Trv. Strain 970 жана Blc да бөлүнүп чыккан. Ирис түзүлүшү (9, 10, 12) RC-LH1 комплексиндеги сакталган жардамчы хинон байланышуу ордун көрсөтүп турат (S12G-сүрөт). RC-LH116дагы беш ажыроочу UQ жогорку натыйжалуу суюктук хроматографиясы (HPLC) менен аныкталган ар бир комплекстин 5,8±0,7 маанисине жакшы дал келет, ал эми RC-LH114-Wдеги үч ажыроочу UQ төмөнкүдөн төмөн. Өлчөнгөн 6,2±0,3 мааниси (S14-сүрөт) түзүлүштө чечилбеген UQ молекулалары бар экенин көрсөтүп турат.
Псевдо-симметриялык L жана M полипептиддеринин ар бири бештен TMH камтыйт жана бир BChl димерин, эки BChl мономерин, эки бактериофаг (BPh) мономерин жана бир гем эмес темирди жана бир же эки UQ10 молекуласын бириктирген гетеродимерди түзөт. Терминалдык кетон тобунда суутек байланыштарынын болушу жана анын Rpsте белгилүү топтолушу аркылуу каротиноиддер цис-3,4-дегидрооргодопин деп аталган M-суббирдигине кошулат. Түрлөр (25). RC-H сырткы мембранасынын домени мембранага бир TMH менен бекитилген. Жалпы RC түзүлүшү окшош түрлөрдүн (мисалы, Rba) үч суббирдигинин RCсине окшош. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl жана BPh макроциклдери, каротиноиддик омурткасы жана гем эмес темир, ошондой эле QA сайтындагы UQ10 баш тобу жана RC-LH116дагы QB хинон (S15-сүрөт) бул структуралардын чечилиш диапазонунда дал келет.
QB сайтынын ээлөө ылдамдыгы ар кандай болгон эки RC структурасынын болушу QB хинонунун байланышы менен коштолгон ырааттуу конформациялык өзгөрүүлөрдү изилдөө үчүн жаңы мүмкүнчүлүк берет. RC-LH116 комплексинде QB хинону толугу менен байланышкан "проксималдык" абалда жайгашкан (26), бирок RC-LH114-W бөлүнгөн жеринде QB хинон жок. RC-LH114-Wде QB хинон жок, бул таң калыштуу, анткени комплекс активдүү, структуралык жактан чечилген QB хинонуна ээ RC-LH116 комплексине караганда көбүрөөк. Эки LH1 шакекчеси болжол менен алты хинонду хелаттаса да, бешөө жабык RC-LH116 шакекчесинде структуралык жактан чечилет, ал эми ачык RC-LH114-W шакекчесинде үчөө гана структуралык жактан чектелген. Бул структуралык бузулуунун күчөшү RC-LH114-W QB сайттарынын тезирээк алмаштырылышын, комплексте хинон кинетикасынын тездешин жана LH1 циклинен өтүү ыктымалдыгынын жогорулашын чагылдырышы мүмкүн. Биз RC-LH114-Wнин RC QB сайтында UQ жоктугу татаалыраак жана активдүүрөөк комплекстин натыйжасы болушу мүмкүн деп божомолдойбуз жана RC-LH114-Wнин QB сайты UQ айлануусунда дароо тоңуп калган. Белгилүү бир этап (QB сайтына кире бериш жабылган) бул активдүүлүктүн конформациясын чагылдырат.
QB болбосо, L-Phe217нин UQ10 байланышы менен шайкеш келбеген абалга айланышы байкалат, анткени ал куйруктун биринчи изопрен бирдиги менен мейкиндик кагылышуусуна алып келет (6A-сүрөт). Мындан тышкары, негизги конформациялык өзгөрүүлөр байкалат, айрыкча спираль de (TMH D жана E ортосундагы циклдеги кыска спираль), мында L-Phe217 QB байланыш чөнтөгүнө жылдырылат жана L-Tyr223 айланышы (6A-сүрөт) M-Asp45 алкагы менен суутек байланышын үзүү жана QB байланышуу жеринин кире беришин жабуу үчүн (6B-сүрөт). Спираль өзүнүн негизинде айланып, L-Ser209дун Cα 0,33Å жылдырылат, ал эми L-Val221Cα 3,52Å жылдырылат. TMH D жана Eде байкалуучу өзгөрүүлөр жок, алар эки структурада тең бири-бирине дал келет (6A-сүрөт). Биз билгенден, бул табигый RCдеги QB сайтын жапкан биринчи түзүлүш. Толук (QB менен байланышкан) түзүлүш менен салыштыруу хинон калыбына келгенге чейин, анын хинонго кириши үчүн конформациялык өзгөрүү талап кылынарын көрсөтөт. L-Phe217 хинондун баш тобу менен π-үйлөнүү өз ара аракеттенүүсүн түзүү үчүн айланат, ал эми спираль сыртка жылып, L-Gly222 скелети жана L-Tyr223 каптал чынжыры туруктуу суутек байланышы түзүлүшүнө ээ суутек байланыш тармагын түзүүгө мүмкүндүк берет (6-сүрөт, А жана С).
(A) Голограмманын (L чынжыры, кызгылт сары/M чынжыры, кызгылт көк) жана апо (боз) түзүлүшүнүн бири-бирине дал келген мультфильми, анда негизги калдыктар таякча сымал сүрөттөлүш түрүндө көрсөтүлгөн. UQ10 сары тилке менен көрсөтүлгөн. Чекиттүү сызык бүтүндөй түзүлүштө пайда болгон суутек байланыштарын көрсөтөт. (B жана C) Аполипопротеиндин жана бүтүндөй шакекче түзүлүшүнүн беттик сүрөттөлүшү, тиешелүүлүгүнө жараша көк түстө L-Phe217 жана кызыл түстө L-Tyr223 каптал чынжыр кычкылтегин белгилейт. L суббирдиги кызгылт сары түстө; M жана H суббирдиктери түстүү эмес. (D жана E) Аполипопротеин (D) жана бүтүн (E) RC QB сайттары [тиешелүүлүгүнө жараша (A) менен түстө] жана Thermophilus thermophilus PSII (жашыл, пластик хинон менен көк; PDB ID: 3WU2) Тегиздөө (58).
Күтүлбөгөн жерден, LH1сиз QB жетишсиз RCлердин бир нече түзүлүштөрү бар болгону менен, бул изилдөөдө байкалган конформациялык өзгөрүүлөр мурда кабарланган эмес. Аларга Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) жана Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29) дан алынган QBнын азайышы кирет, алардын баары жалпы QB түзүлүшүнө дээрлик окшош. 3PRCди кылдаттык менен текшерүү LDAO (Лаурил Диметил Амин Оксиди) жуугуч молекулалары QB позициясынын кире беришинде байланышаарын көрсөттү, бул жабык конформацияга кайра жайгашууга жол бербеши мүмкүн. LDAO 1EYS же 1OGVде бир эле позицияда ажырабаса да, бул RCлер бир эле жуугуч каражатты колдонуу менен даярдалат жана ошондуктан бирдей эффект бериши мүмкүн. Rbaнын кристаллдык түзүлүшү. Цитохром c2 менен бирге кристаллдашкан Sphaeroides RC (PDB ID: 1L9B) да жабык QB сайтына ээ окшойт. Бирок, бул учурда, RC-M полипептидинин N-терминалдык аймагы (Q спиралындагы Tyr калдыгынын H байланышы аркылуу QB байланыш сайты менен өз ара аракеттенет) табигый эмес конформацияны кабыл алат жана QB конформациялык өзгөрүшү андан ары изилденбейт (30). RC-LH114-W түзүмүндө M полипептидинин мындай деформациясын көргөн жокпуз, бул RC-LH116 RCнин N-терминалдык аймагы менен дээрлик бирдей. Ошондой эле, жуугуч каражатка негизделген LH1 антеннасын жок кылгандан кийин, PDBдеги аполипопротеин RCлер чечилгенин, бул RC менен аны курчап турган LH1 шакекчесинин ички бетинин ортосундагы боштуктагы ички хинон бассейндерин жана липиддерди жок кылганын белгилей кетүү керек (31, 32). RC бардык кофакторлорду сактап калгандыктан, функционалдуу бойдон калат, анткени ал анча туруктуу эмес жана даярдоо процессинде көп учурда жоголуп кетүүчү ажыроочу QB хинонунан башка бардык кофакторлорду сактап калат (33). Мындан тышкары, RCден LH1 жана табигый циклдик липиддерди алып салуу функцияларга, мисалы, заряд менен бөлүнгөн P+QB-абалынын иштөө мөөнөтүн кыскартууга таасир этиши мүмкүн экени белгилүү (31, 34, 35). Ошондуктан, биз RCди курчап турган жергиликтүү LH1 шакекчесинин болушу "жабык" QB сайтын сактап калышы мүмкүн, ошону менен QB жанындагы жергиликтүү чөйрөнү сактап калышы мүмкүн деп божомолдойбуз.
Аполипопротеин (QB хинонсуз) жана толук түзүлүш QB сайтынын алмашуусунун бир катар окуяларды эмес, эки гана сүрөтүн чагылдырса да, гидрохинон менен кайра байланышуунун алдын алуу үчүн байланышты жөнгө салууга болорун көрсөткөн белгилер бар. Аполипопротеиндин QB сайтынын жанындагы хинолон менен хинондун өз ара аракеттенүүсү ар кандай болушу мүмкүн, бул анын RC тарабынан четке кагылышына алып келет. Конформациялык өзгөрүүлөр хинондордун байланышында жана калыбына келүүсүндө роль ойнойт деген көптөн бери айтылып келет. Тоңдурулган RCлердин караңгы адаптациядан кийин хинондорду калыбына келтирүү жөндөмү бузулат (36); Рентген кристаллографиясы бул зыян QB хинондорунун активдүү проксималдык абалдан болжол менен 4,5 Å аралыкта "дисталдык" конформацияда камалып калышынан келип чыкканын көрсөтүп турат (26), 37). Биз бул дисталдык байланыш конформациясы аполипопротеин менен толук шакекче түзүлүшүнүн ортосундагы аралык абалдын сүрөтү деп божомолдойбуз, ал хинон менен баштапкы өз ара аракеттенүүдөн жана QB сайтынын ачылышынан кийин болот.
Айрым фототрофтук бактериялардын жана цианобактериялардын, балырлардын жана өсүмдүктөрдүн PSII комплексинде кездешкен II типтеги RC структуралык жана функционалдык консервацияга ээ (38). 6-сүрөттө (D жана E) көрсөтүлгөн структуралык тегиздөө PSII RC менен бактериялык RC комплексинин QB сайтынын окшоштугун баса белгилейт. Бул салыштыруу хинон менен байланышуунун жана калыбына келүүнүн тыгыз байланышкан системаларын изилдөө үчүн көптөн бери үлгү болуп келген. Мурунку басылмаларда конформациялык өзгөрүүлөр хинондордун PSII калыбына келиши менен коштолот деп айтылган (39, 40). Ошондуктан, RCнин эволюциялык сакталышын эске алганда, мурда байкалбаган бул байланыш механизми кычкылтек менен байытылган фототрофтук өсүмдүктөрдөгү PSII RCнин QB сайтына да тиешелүү болушу мүмкүн.
Rps ΔpufW (белгисиз pufW делециясы) жана PufW-His (табигый pufW локусунан экспрессияланган C-терминалдык 10x His-белгиленген белок-W) штаммдары. palustris CGA009 мурунку ишибизде (16) сүрөттөлгөн. Бул штаммдар жана изогендик жапайы типтеги ата-эне PYE (ар бири 5 г литр -1) (LBде -80 °C температурада сакталган, курамында 50% (w/v) глицерин) белок, ачыткы экстракты жана сукцинат) агар [1,5% (w/v)] камтылган пластинкага аз сандагы клеткаларды сызып алуу менен тоңдургучтан алынган. Пластинка бөлмө температурасында анаэробдук шарттарда караңгыда түнү бою инкубацияланган, андан кийин OSRAM 116-W галоген лампалары (RS Components, Улуу Британия) тарабынан берилген ак жарык (~50 мкмоль-2 с-1) менен бир колония пайда болгонго чейин 3-5 күн бою жарыктандырылган. Бир колония 0,1% (салмак/көлөм) казаминокислоталар (мындан ары M22 деп аталат) кошулган 10 мл M22+ чөйрөсүн (41) эмдөө үчүн колдонулган. Культура кычкылтек аз болгон шарттарда караңгыда 34°C температурада 180 айн/мин ылдамдыкта 48 саат чайкалып өстүрүлгөн, андан кийин 70 мл культура ошол эле шарттарда 24 саат бою эмделген. 30 мл универсалдуу бурама үстү бар тунук айнек бөтөлкөгө 30 мл M22 чөйрөсүн эмдөө үчүн 1 мл көлөмүндөгү жарым аэробдук культура колдонулат жана стерилдүү магниттик күч менен аралаштыруу таякчасы менен 48 саат бою аралаштырып (~50μмольм-2 с-1) нурландырылган. Андан кийин 30 мл культура ошол эле шарттарда болжол менен 1 литр культура менен эмделген, андан кийин ал болжол менен 9 литр культураны ~200 мкмольм-2 с-1 температурада 72 саат бою эмдөө үчүн колдонулган. Клеткалар 7132 RCFде 30 мүнөт центрифугалоо жолу менен жыйналып, ~10 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эритмесинде кайра эритилип, керек болгонго чейин -20°C температурада сакталган.
Эригенден кийин, кайра эритилген клеткаларга дезоксирибонуклеаза I (Merck, Улуу Британия) кристаллдарын, лизоцимди (Merck, Улуу Британия) жана эки Roche голоэнзим протеаза ингибитор таблеткаларын (Merck, Улуу Британия) кошуңуз. 20 000 psi француз басым клеткасында (Aminco, АКШ) клеткалар 8-12 жолу бузулган. Сынбаган клеткаларды жана эрибеген калдыктарды 18 500 RCFде 4°C температурада 15 мүнөт центрифугалоо менен алып салгандан кийин, мембрана пигменттүү лизаттан 113 000 RCFде 43 000°C температурада 2 саат центрифугалоо менен чөктүрүлгөн. Эриген фракцияны алып салып, түстүү мембрананы 100-200 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эритмесинде кайра эритип, көрүнгөн агрегаттар жок болгонго чейин гомогендештириңиз. Асылган мембрана 2% (w/v) β-DDM камтыган 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) (Anatrace, АКШ) эритмесинде караңгыда 4°C температурада 1 саат бою акырын аралаштырып инкубацияланган. Андан кийин калган эрибеген заттарды алып салуу үчүн 150 000 RCFти 4°C температурада 1 саат бою эритүү үчүн 70°C температурада центрифугаланган.
ΔpufW штаммынан алынган эритүүчү мембрана үч колонка көлөмү (CV) байланыштыруучу буфери бар [20 мМ трис-HCl (рН 8.0) 0.03% (w / v) β-DDM камтыган] 50 мл DEAE Сефароза ион алмашуу колонкасына колдонулган. Колонканы эки CV байланыштыруучу буфер менен жууп, андан кийин колонканы 50 мМ NaCl камтыган эки байланыштыруучу буфер менен жууп салыңыз. RC-LH116 комплекси 1.75 CVде 150дөн 300 мМ NaClге чейинки сызыктуу градиент менен (байланыштыруучу буферде) элюцияланган, ал эми калган байланыштыруучу комплекс 0.5 CVде 300 мМ NaCl камтыган байланыштыруучу буфер менен элюцияланган. 250 жана 1000 нм ортосундагы абсорбция спектрин чогултуп, абсорбция катышы (A880/A280) 1ден жогору фракцияны 880ден 280 нмге чейин кармап, байланыштыруучу буферде эки жолу суюлтуп, ошол эле процедураны DEAE тилкесинде "Тазалоо жөнүндө" кайрадан колдонуңуз. A880/A280 катыштары 1,7ден жогору жана A880/A805 катыштары 3,0дон жогору фракцияларды суюлтуп, ион алмашуунун үчүнчү раундун жүргүзүп, A880/A280 катыштары 2,2ден жогору жана A880/A805 катыштары 5,0дөн жогору фракцияларды сактап коюңуз. Жарым-жартылай тазаланган комплекс Amicon 100 000 молекулярдык салмактагы кесүү (MWCO) борбордон чегинүүчү чыпкасында (Merck, Улуу Британия) ~2 мл чейин концентрацияланган жана 200 мМ NaCl буферин камтыган Superdex 200 16/600 өлчөмдөгү четтетүү колонкасына (GE Healthcare, АКШ) жүктөлгөн, андан кийин ошол эле буферде 1,5 CVде элюцияланган. Өлчөмдү четтетүү фракциясынын сиңирүү спектрлерин чогултуп, сиңирүү спектрлерин 2,4төн жогору A880/A280 катыштары жана 5,8ден 100гө чейинки A880/A805 катыштары менен концентрациялап, аларды дароо крио-TEM торчосун даярдоо же сактоо үчүн колдонуңуз. Керек болгонго чейин -80°C температурада сактаңыз.
PufW-His штаммынан алынган эритүүчү мембрана IMAC буфериндеги 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose колонкасына (200 мМ NaCl жана 0,03% (салмак/салмак) камтыган 20 мМ трис-HCl (рН 8.0)) IMAC буферине (GE Healthcare) сүйкөлгөн. v) β-DDM]. Колонна беш CV IMAC буфери менен, андан кийин 10 мМ гистидин камтыган беш CV IMAC буфери менен жуулган. Өзөктүк комплекс колонкадан 100 мМ гистидин камтыган беш IMAC буфери менен элюцияланган. RC-LH114-W комплексин камтыган фракция Amicon 100,000 MWCO чыпкасы (Merck, Улуу Британия) менен жабдылган аралаштырылган резервуарда ~10 млге чейин концентрацияланган, байланыштыруучу буфер менен 20 жолу суюлтулган жана андан кийин 25 млге кошулган. DEAE Sepharose колонкасында буферге байланган төрт CV алдын ала колдонулат. Колонканы төрт CV байланыштыруучу буфер менен жууп, андан кийин комплексти сегиз CVде 0дон 100 мМ NaClге чейинки сызыктуу градиентте (байланыштыруучу буферде) элюциялаңыз, ал эми калган төрт CVде 100 мМ байланыштыруучу буфер бар. Натрий хлоридинде элюцияланган калдык комплекстер A880/A280 катышы 2,4төн жогору жана A880/A805 катышы 4,6дан жогору фракциялар менен айкалышып, Amicon 100,000 MWCO борбордон четтөөчү чыпкасында ~2 млге чейин концентрацияланып, алдын ала 1,5 CV IMAC менен толтурулган. Буфер Superdex 200 16/600 өлчөмүндөгү четтетүү колонкасын тең салмактап, андан кийин ошол эле буферде 1,5 CV үстүндө элюцияланган. Өлчөмдү алып салуучу фракциялардын сиңирүү спектрлерин чогултуп, сиңирүү спектрлерин 2,1ден жогору A880/A280 катыштары жана 4,6дан жогору A880/A805 катыштары менен 100 A880ге чейин топтогула, алар дароо тоңдурулган TEM торчосун даярдоо үчүн колдонулат же -80°C температурада керек болгонго чейин сакталат.
Төмөнкү температурадагы TEM торчолорун даярдоо үчүн Leica EM GP чөмүлүүчү тоңдургучу колдонулган. Комплекс IMAC буферинде A880 50 чейин суюлтулган, андан кийин 5μl жаңы жарык менен разряддалган QUANTIFOIL 1.2/1.3 көмүртек менен капталган жез торчосуна (Agar Scientific, Улуу Британия) жүктөлгөн. Торчо 20°C температурада жана 60% салыштырмалуу нымдуулукта 30 секунд инкубацияланып, андан кийин 3 секунд кургатып, андан кийин -176°C температурада суюк этанда чыңалган.
RC-LH114-W комплексинин маалыматтары 300 кВ ылдамдануу чыңалуусунда иштеген, номиналдык чоңойтуу 130 000× жана 20 эВ энергиясы бар Titan Krios микроскобу менен eBIC (Электрондук биовизуализация борбору) (Британдык алмаз жарык булагы) микроскобуна жазылып алынган. Маалыматтарды чогултуу үчүн эсептөө режиминде сүрөттөрдү жаздыруу үчүн K2 пик детектору бар Gatan 968 GIF Quantum колдонулган. Калибрленген пикселдин өлчөмү 1,048Å, ал эми дозанын ылдамдыгы 3,83 e-Å-2s-1. Плёнканы 11 секундда чогултуп, 40 бөлүккө бөлдү. Микроскопту кайра фокустоо үчүн көмүртек менен капталган аймакты колдонуңуз, андан кийин ар бир тешиктен үч плёнка чогултуңуз. Жалпысынан 3130 плёнка чогултулган, дефокустук маанилери -1 жана -3 мкм ортосунда болгон.
RC-LH116 комплексинин маалыматтары ошол эле микроскоптун жардамы менен Астербери биоструктура лабораториясында (Лидс университети, Улуу Британия) чогултулган. Маалыматтар 130 к чоңойтуу менен эсептөө режиминде чогултулган жана пикселдин өлчөмү 4,6 e-Å-2s-1 дозасы менен 1,065 Å чейин калибрленген. Тасма 12 секунданын ичинде жазылып, 48 бөлүккө бөлүнгөн. Жалпысынан 3359 тасма чогултулган, дефокустук маанилери -1 жана -3 мкм ортосунда болгон.
Бардык маалыматтарды иштетүү Relion 3.0 түтүгүндө (42) жүргүзүлөт. Дозаны салмактоо менен нурдун кыймылын оңдоо үчүн Motioncorr 2 (43) колдонуңуз, андан кийин CTF (контрасттык өткөрүү функциясы) параметрин аныктоо үчүн CTFFIND 4.1 (44) колдонуңуз. Бул баштапкы иштетүү этаптарынан кийинки типтүү фотомикрографтар 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. S16. Автоматтык тандоо шаблону 250 пикселдик кадрда жана эч кандай шилтеме эки өлчөмдүү (2D) классификациясы жок 1000 бөлүкчөнүн болжол менен 250 пикселин кол менен тандоо аркылуу түзүлөт, ошону менен үлгүнүн булганышына жооп берген же эч кандай айырмалануучу мүнөздөмөсү жок классификациялар четке кагылат. Андан кийин, бардык микрофотосуреттерде автоматтык тандоо жүргүзүлдү жана RC-LH114-W 849 359 бөлүкчө, ал эми RC-LH116 комплекси 476 547 бөлүкчө болгон. Тандалган бөлүкчөлөрдүн баары эки айлампада шилтеме бербеген 2D классификациясынан өтүштү жана ар бир текшерүүдөн кийин көмүртек аймагына туура келген, үлгүнүн булганышы, эч кандай айкын белгилери жок же катуу бири-бирине дал келген бөлүкчөлөр четке кагылат, натыйжада 772 033 (90,9%) жана 359 678 (75,5%) бөлүкчөлөр RC-LH114-W жана RC-LH116 3D классификациясы үчүн колдонулат. Баштапкы 3D шилтеме модели стохастикалык градиенттик түшүү ыкмасын колдонуу менен түзүлгөн. Баштапкы моделди шилтеме катары колдонуп, тандалган бөлүкчөлөр 3D форматында төрт категорияга бөлүнөт. Бул категориядагы моделди шилтеме катары колдонуп, эң чоң категориядагы бөлүкчөлөрдү 3D тазалоону жүргүзүңүз, андан кийин эриткич аймагын жабуу үчүн баштапкы 15Å төмөнкү өткөргүчтүү чыпканы колдонуңуз, жумшак четтерден 6 пиксел кошуңуз жана жогорку детектордун Gatan K2 чокусунун модуляциясын өткөрүү функциясын оңдоо үчүн пикселдерди кийин иштетиңиз. RC-LH114-W маалыматтар топтому үчүн бул баштапкы модель маска четтериндеги күчтүү тыгыздыкты алып салуу менен өзгөртүлгөн (UCSF Chimeraдагы өзөктүк комплекс тыгыздыгынан ажыратылган). Натыйжада алынган моделдер (RC-LH114-W жана RC-LH116 чечилиштери тиешелүүлүгүнө жараша 3,91 жана 4,16 Å) 3D классификациясынын экинчи айлампасы үчүн шилтеме катары колдонулат. Колдонулган бөлүкчөлөр баштапкы 3D классына топтоштурулган жана коңшулук менен күчтүү корреляцияны камтыбайт. Бири-бирине дал келет же айкын структуралык өзгөчөлүктөрдүн жоктугу. 3D классификациясынын экинчи айлампасынан кийин эң жогорку чечилишке ээ категория тандалып алынган [RC-LH114-W үчүн бир категория 377 703 бөлүкчө (44,5%), RC-LH116 үчүн жалпысынан 260 752 бөлүкчө (54,7%) болгон эки категория бар, мында алар баштапкы айлануудан кийин кичинекей айырма менен тегизделгенде гана бирдей болот]. Тандалган бөлүкчөлөр 400 пикселдик кутуга кайра алынып, 3D тазалоо аркылуу тазаланат. Эриткич маскасы баштапкы 15Å төмөнкү өткөргүчтүү чыпканы, 3 пикселдик карта кеңейтүүсүн жана 3 пикселдик жумшак масканы колдонуу менен түзүлөт. Ар бир бөлүкчө үчүн CTF тазалоо, ар бир бөлүкчө үчүн кыймылды оңдоо жана ар бир бөлүкчө үчүн CTF тазалоонун экинчи айлампасын колдонуу менен, ар бир кадамдан кийин алынган текстураны андан ары тактоо үчүн 3D тазалоо, эриткичти маскировкалоо жана кийинки иштетүү жүргүзүлөт. FSC (Фурье кабыгынын корреляция коэффициенти) кесүү мааниси 0,143 колдонулуп, RC-LH114-W жана RC-LH116 акыркы моделдеринин чечилиштери тиешелүүлүгүнө жараша 2,65 жана 2,80Å түзөт. Акыркы моделдин FSC ийри сызыгы 2-сүрөттө көрсөтүлгөн. S17.
Бардык белок ырааттуулуктары UniProtKBден жүктөлүп алынган: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). RC-L, RC-M жана RC-H белок ырааттуулуктарын жана Rba кристаллдык түзүлүшүн камтыган RC гомологиялык моделин түзүү үчүн SWISS-MODEL (45) колдонулган. Шаблон катары RC колдонулган (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera программасындагы "картага тууралоо" куралын колдонуп, түзүлгөн моделди картага (47) тууралаңыз, белоктун түзүлүшүн жакшыртыңыз жана кофактор [4×BChlα (мономер китепканасынын калдыгынын аталышы = BCL), 2×BPhα (BPH), бир же эки түрдүү UQ10 (U10), бир гем эмес темир (Fe) жана бир 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (QAK)] кошуңуз. QAK мономер китепканасында жок болгондуктан, ал PHENIX программасындагы (49) eLBOW куралын колдонуп параметрлештирилген.
Андан кийин, LH1 суббирдиги курулган. Башында, PHENIX (49) программасындагы автоматтык куруу куралы картаны жана LH1-α жана LH1-β белок ырааттуулугун киргизүү катары колдонуп, LH1 ырааттуулугунун бир бөлүгүн автоматтык түрдө куруу үчүн колдонулган. Эң толук LH1 суббирдигин тандап, аны бөлүп алып, Cootко жүктөңүз, ага жок ырааттуулукту кол менен кошуңуз жана эки BCl a (BCL) жана спириллоксантин (CRT) кошуудан мурун бүт түзүлүштү кол менен тактаңыз [тиешелүү Rps ылайык. LH1 комплексинин тыгыздыгы жана белгилүү каротиноиддик мазмун. Түрлөр (17)]. LH1 толук суббирдигин көчүрүп, UCSF Chimera “Докинг картасы куралын” колдонуп, LH1 тыгыздыгынын жанаша жайгашкан моделдик эмес аймагына докко коюңуз, андан кийин аны Cootко тактаңыз; бардык LH1 суббирдиктери моделделгенге чейин процессти кайталаңыз. RC-LH114-W түзүлүшү үчүн, Cootтогу бөлүштүрүлбөгөн тыгыздыкты бөлүп алуу менен, белок USCF Химера картасындагы калган белок эмес компоненттерден сегменттелет жана баштапкы моделди түзүү үчүн Autobuild куралы колдонулат, ал эми калган суббирдиктерди (белок-W) Моделдөө. PHENIXте (49). Cootто (48) алынган моделге жок ырааттуулуктарды кошуп, андан кийин бүтүндөй суббирдикти кол менен тактаңыз. Калган бөлүштүрүлбөгөн тыгыздык липиддердин (CDL = CDL, POPC = 6PL жана POPG = PGT PDB мономер китепканасынын IDси), β-DDM жуугуч каражатынын (LMT) жана UQ10 молекулаларынын (U10) айкалышына туура келет. Моделдин статистикасын жана дал келүүнүн визуалдык сапатын андан ары жакшыртууга мүмкүн болбогонго чейин толук баштапкы моделди өркүндөтүү үчүн Cootто (48) PHENIX оптималдаштыруусун (49) жана кол менен оптималдаштырууну колдонуңуз. Акырында, жергиликтүү картаны тактоо үчүн LocScale (50) колдонуңуз, андан кийин бөлүштүрүлбөгөн тыгыздыкты моделдөөнүн жана автоматтык жана кол менен оптималдаштыруунун башка бир нече циклдерин аткарыңыз.
Тийиштүү пептиддер, кофакторлор жана башка липиддер жана хинондор өздөрүнүн тыгыздыктарында жайгашкан 1 жана 2-сүрөттөрдө көрсөтүлгөн. S18ден S23кө чейин. Акыркы моделдин статистикалык маалыматы S1 таблицасында көрсөтүлгөн.
Эгерде башкача көрсөтүлбөсө, UV/Vis/NIR жутулуу спектрлери Cary60 спектрофотометринде (Agilent, АКШ) 250 нмден 1000 нмге чейинки 1 нм аралыкта жана 0,1 с интеграция убактысында чогултулган.
Үлгүнү 2 мм жол менен кварц кюветасында A880 1ге чейин суюлтуп, 400 жана 1000 нм ортосундагы жутуу спектрин чогултуңуз. Тегерек дихроикалык спектрлер Jasco 810 спектрополяриметринде (Jasco, Япония) 400 нм жана 950 нм ортосундагы 1 нм аралыкта 20 нм мин-1 сканерлөө ылдамдыгында чогултулган.
Молярдык экстинкция коэффициенти өзөктүк комплексти болжол менен 50гө A880 чейин суюлтуу менен аныкталат. 10 мкл көлөмдү 990 мкл байланыштыруучу буферге же метанолго суюлтуп, BChl деградациясын минималдаштыруу үчүн абсорбция спектрин дароо чогултуңуз. Ар бир метанол үлгүсүнүн BChl курамы 54,8 мМ-1 см-1 771 нмдеги экстинция коэффициенти менен эсептелген жана экстинция коэффициенти аныкталган (51). Өзөктүк комплекстин концентрациясын аныктоо үчүн өлчөнгөн BChl концентрациясын 32ге (RC-LH114-W) же 36га (RC-LH116) бөлүңүз, андан кийин ал буферде чогултулган ошол эле үлгүнүн абсорбция спектрин аныктоо үчүн колдонулат. Экстинкция коэффициенти. параллель. Ар бир үлгү үчүн үч кайталанган өлчөө жүргүзүлдү жана эсептөө үчүн BChl Qy максимумунун орточо абсорбциясы колдонулган. 878 нмде өлчөнгөн RC-LH114-W өчүү коэффициенти 3280±140 мМ-1 см-1, ал эми 880 нмде өлчөнгөн RC-LH116 өчүү коэффициенти 3800±30 мМ-1 см-1 түзөт.
UQ10 (52)деги ыкмага ылайык сандык жактан аныкталган. Кыскасы, тескери фазадагы HPLC (RP-HPLC) Agilent 1200 HPLC системасын колдонуу менен жүргүзүлдү. 0,02% (w/v) темир хлоридин камтыган 50 мкл 50:50 метанол:хлороформдо болжол менен 0,02 нмоль RC-LH116 же RC-LH114-W эритип, алдын ала тең салмакталган Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 мм эритмесин × 25 см тилкеге ​​40°C температурада 1 мл-1 мин-1 эритмеде эритип, 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноиддер) жана 780 нм (BChl) толкундарында 1 саат бою абсорбцияны көзөмөлдөө үчүн HPLC эритмесинде изократиялык элюция жүргүзүңүз. 275 нм хроматограммадагы 25,5 мүнөттөгү чоку интеграцияланган, анда башка аныкталуучу кошулмалар болгон эмес. Интегралдык аянт 0дөн 5,8 нмольго чейинки таза стандарттарды куюудан эсептелген калибрлөө ийри сызыгына таянып, бөлүнүп алынган UQ10 молярдык көлөмүн эсептөө үчүн колдонулат (S14-сүрөт). Ар бир үлгү үч кайталоодо талданган жана билдирилген ката орточо көрсөткүчтүн SD маанисине туура келет.
RC-LH1 комплексин камтыган, максималдуу Qy сиңирүүсү 0,1 болгон эритме 30 мкМ калыбына келтирилген жылкынын жүрөгүнүн цитохрому c2 (Merck, Улуу Британия) жана 0дон 50 мкMUQ2 (Merck, Улуу Британия) менен даярдалган. Ар бир UQ2 концентрациясында үч 1 мл үлгү даярдалып, өлчөөдөн мурун караңгылыкка толук ыңгайлашууну камсыз кылуу үчүн караңгыда 4°C температурада түнү бою инкубацияланган. Эритме 300 нм жалын/500 сызык торчосу, 1,24 мм кириш, 0,12 мм ортоңку жана 0,6 мм чыгуучу тешиктери менен жабдылган OLIS RSM1000 модулдук спектрофотометрине жүктөлгөн. Козготкуч жарыкты жокко чыгаруу үчүн үлгү фототүтүкчөсүнүн жана эталондук фотокөбөйткүч түтүкчөсүнүн кире беришине 600 нм узундуктагы өткөргүч чыпка коюлган. Абсорбция 0,15 с интеграция убактысы менен 550 нмде көзөмөлдөнгөн. Козгогуч жарык 880 нм M880F2 LED (Жарык чыгаруучу диод) (Thorlabs Ltd., Улуу Британия) аркылуу DC2200 контроллери (Thorlabs Ltd., Улуу Британия) аркылуу 90% интенсивдүүлүктө була-оптикалык кабель аркылуу чыгарылат жана жарык булагына 90° бурч менен чыгарылат. Өлчөөчү нур күзгүгө карама-каршы коюлуп, үлгү тарабынан башында сиңирилбеген жарыкты кайтарып берет. 50 секунд жарыктан мурун сиңирүүнү 10 секунд көзөмөлдөңүз. Андан кийин хинололдун цитохром c23+ стихиялуу түрдө канчалык деңгээлде калыбына келтирерин баалоо үчүн караңгыда 60 секунд бою сиңирүүнү андан ары көзөмөлдөңүз (чийки маалыматтар үчүн S8-сүрөттү караңыз).
Маалыматтар 0,5тен 10 секундга чейинки сызыктуу баштапкы ылдамдыкты орнотуу (UQ2 концентрациясына жараша) жана ар бир UQ2 концентрациясындагы үч үлгүнүн тең ылдамдыктарын орточо эсептөө аркылуу иштетилген. Тиешелүү өчүрүү коэффициенти менен эсептелген RC-LH1 концентрациясы ылдамдыкты каталитикалык натыйжалуулукка айландыруу үчүн колдонулган, ал Origin Pro 2019 (OriginLab, АКШ) программасында көрсөтүлгөн жана көрүнгөн Km жана Kcat маанилерин аныктоо үчүн Michaelis-Menten моделине ылайыкташтырылган.
Убактылуу абсорбцияны өлчөө үчүн, RC-LH1 үлгүсү 50 мМ натрий аскорбатын (Merck, АКШ) жана 0,4 мМ Тербутинди (Merck, АКШ) камтыган IMAC буферинде ~2μM чейин суюлтулган. Аскорбин кислотасы курмандык электрон донору катары колдонулат, ал эми терт-бутаклофен QB ингибитору катары колдонулат, бул негизги RC донорунун өлчөө процессинде калыбына келтирилген бойдон калышын (б.а. фотокычкылданбагандыгын) камсыз кылат. Лазердик жолдогу үлгүнүн козгоо импульстарынын ортосунда караңгы адаптациялануу үчүн жетиштүү убакытка ээ болушун камсыз кылуу үчүн, болжол менен 3 мл үлгү 2 мм оптикалык жол узундугу бар атайын айлануучу клеткага (диаметри болжол менен 0,1 м, 350 RPM) кошулат. Үлгүнү 880 нмде 1 кГц кайталоо ылдамдыгында (NIR үчүн 20 нДж же Vis үчүн 100 нДж) козгоо үчүн Ti: Sapphire лазер системасын (Spectra Physics, АКШ) күчөтүү үчүн ~100-fs лазер импульстарын колдонуңуз. Маалыматтарды чогултуудан мурун, үлгүнү болжол менен 30 мүнөт дүүлүктүрүүчү жарыкка коюңуз. Экспозиция QA инактивдешүүсүнө алып келет (мүмкүн, QAны бир же эки жолу азайтат). Бирок, бул процесс кайтарымдуу экенин эске алыңыз, анткени узак убакыт бою караңгы адаптациядан кийин RC акырындык менен QA активдүүлүгүнө кайтып келет. -10дон 7000 psке чейинки кечигүү убактысы менен өткөөл спектрлерди өлчөө үчүн Helios спектрометри (Ultrafast Systems, АКШ) колдонулган. Маалыматтар топтомун бөлүп, андан кийин бириктирип жана стандартташтыруу үчүн Surface Xplorer программасын (Ultrafast Systems, АКШ) колдонуңуз. Ажырашууга байланыштуу дифференциалдык спектрлерди алуу үчүн айкалышкан маалыматтар топтомун колдонуу үчүн CarpetView программалык пакетин (Light Conversion Ltd., Литва) колдонуңуз же Origin (OriginLab, АКШ) бир толкун узундугундагы спектрдик эволюцияга туура келүү үчүн бир нече көрсөткүчтөрдү аспаптын жообу менен айкалыштырган функцияны колдонуңуз.
Жогоруда айтылгандай (53), RC жана перифериялык LH2 антеннасы жок LH1 комплексин камтыган фотосинтетикалык пленка даярдалган. Мембрана 20 мМ трис (рН 8.0) менен суюлтулуп, андан кийин 2 мм оптикалык жолу бар кварц кюветага жүктөлгөн. Үлгүнү 540 нмде -10дон 7000 пске чейинки кечигүү убактысы менен козгоо үчүн 30 нДж лазердик импульс колдонулган. Маалыматтар топтомун Rps. pal үлгүсү үчүн сүрөттөлгөндөй иштетиңиз.
Мембрана 150 000 RCFде 4°C температурада 2 саат бою центрифугалоо жолу менен гранулдандырылган, андан кийин анын 880 нмдеги абсорбциясы 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) жана 200 мМ NaClде кайра эритилген. Мембрананы 2% (w/v) β-DDMди 4°C температурада караңгыда 1 саат бою жай аралаштырып эритүү керек. Үлгү 100 мМ триэтиламмоний карбонатында (рН 8.0) (TEAB; Merck, Улуу Британия) 2.5 мг мл-1 белок концентрациясына чейин суюлтулган (Bio-Rad анализи). Андан ары иштетүү мурда жарыяланган ыкма боюнча (54) жүргүзүлүп, 50 мкг белокту 1% (w/v) натрий лаураты бар жалпысынан 50 мкл TEABге суюлтуудан башталган (Merck, Улуу Британия). 60 секунд ультраүн менен иштетүүдөн кийин, ал 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфин (Merck, Улуу Британия) менен 37°C температурада 30 мүнөт калыбына келтирилген. S-алкилдөө үчүн үлгүнү 10 мМ метил S-метилтиометансульфонат (Merck, Улуу Британия) менен инкубациялап, аны бөлмө температурасында 10 мүнөт 200 мМ изопропанолдун негизги эритмесинен кошуңуз. Протеолитикалык сиңирүү 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C аралашмасын (Promega UK) кошуу жана 37°C температурада 3 саат инкубациялоо жолу менен жүргүзүлдү. Лаурат беттик активдүү зат 50 мкл этилацетатты жана 10 мкл 10% (к/к) LC класстагы трифторуксус кислотасын (TFA; Thermo Fisher Scientific, Улуу Британия) кошуп, 60 секунд вортекстөө менен экстракцияланган. Фазаны бөлүү 15 700 RCFде 5 мүнөт центрифугалоо менен күчөтүлдү. Өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык, пептидди камтыган төмөнкү фазаны кылдаттык менен сордуруп алуу жана тузсуздандыруу үчүн C18 спин колонкасы (Thermo Fisher Scientific, Улуу Британия) колдонулган. Вакуумдук центрифугалоо менен кургатылгандан кийин, үлгү 0,5% TFA жана 3% ацетонитрилде эритилип, 500 нг мурда кеңири баяндалган системанын параметрлерин колдонуп, массалык спектрометрия менен айкалыштырылган нанофлоу RP хроматографиясы аркылуу талданган.
Rps. palustris proteome маалымат базасын (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426) издөө үчүн белокту идентификациялоо жана сандык аныктоо үчүн MaxQuant v.1.5.3.30 (56) колдонуңуз. Массалык спектрометрия протеомикасынын маалыматтары PRIDE өнөктөш репозиторийи (http://proteomecentral.proteomexchange.org) аркылуу PXD020402 маалымат топтомунун идентификатору астында ProteomeXchange Alliance'ке сакталган.
RPLC аркылуу электроспрей иондоштуруу массалык спектрометриясы менен айкалыштырылган анализ үчүн, RC-LH1 комплекси жапайы типтеги Rpsтен даярдалган. Мурда жарыяланган ыкманы (16) колдонуу менен, palustris клеткаларында өндүрүлгөн белоктун концентрациясы 20 мМ Hepes (рН 7.8), 100 мМ NaCl жана 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad анализи)) DDMде 2 мг мл-1 түзгөн. Өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык, 10 мкг белокту чөкмө ыкмасы менен бөлүп алуу үчүн 2D тазалоо комплектин (GE Healthcare, АКШ) колдонуңуз жана чөкмөнү 20 мкл 60% (v/v) кумурска кислотасында (FA), 20% (v/v) ацетонитрилде жана 20% (v/v) сууда эритип алыңыз. Беш микролитр RPLC (Dionex RSLC) аркылуу массалык спектрометрия (Maxis UHR-TOF, Bruker) менен айкалыштырылган анализденген. 60°C жана 100μlmin -1 температурада бөлүү үчүн MabPac 1.2×100 мм тилкесин (Thermo Fisher Scientific, Улуу Британия) колдонуңуз, 85% (v / v) эриткич A [0.1% (v / v) FA жана 0.02% (V/v) TFA суу эритмеси] градиенти менен 85% (v/v) эриткич B [90% (v/v) ацетонитрил TFAда 0.1% (v/v) FA жана 0.02% (v/v)] градиенти менен. Стандарттык электроспрей иондоштуруу булагын жана демейки параметрлерди 60 мүнөттөн ашык убакыт бою колдонуп, массалык спектрометр 100дөн 2750 м/зге чейин (массанын зарядга катышы) алат. ExPASy биоинформатика ресурстук порталынын FindPept куралынын (https://web.expasy.org/findpept/) жардамы менен массалык спектрди комплекстин суббирдиктерине картага түшүрүңүз.
Клеткалар 100 мл NF-аз (10μMm-2 s-1), орто (30μMm-2 s-1) же жогорку (300μMm-2 s-1) жарыкта 72 саат бою өстүрүлдү. M22 чөйрөсү (аммоний сульфаты кошулбай, натрий сукцинаты натрий ацетаты менен алмаштырылган M22 чөйрөсү) 100 мл бурамалуу бөтөлкөгө (23) салынды. Беш 30 секунддук циклде клеткаларды лизиске келтирүү үчүн 0,1 микрондук айнек мончоктор 1:1 көлөмдүк катышта жасалып, музда 5 мүнөт муздатылган. Эрибеген зат, сынбаган клеткалар жана айнек мончоктор үстүнкү микроцентрифугада 16 000 RCFде 10 мүнөт центрифугалоо жолу менен алынып салынды. Мембрана Ti 70.1 роторунда 100 000 RCF менен 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эритмесинде 40/15% (салмак/салмак) сахароза градиенти менен 10 саат бою бөлүнгөн.
Мурунку ишибизде сүрөттөлгөндөй, PufWдеги His тегинин иммундук детектору (16). Кыскасы, 2x SDS жүктөө буфериндеги (Merck, Улуу Британия) тазаланган өзөктүк комплекс (11,8 нМ) же ошол эле концентрациядагы RC камтыган мембрана (кычкылдануу менен аныкталат, кыскартылган айырма спектрин кемитүү жана боёлгон гелдеги жүктөмдү дал келтирүү) эки жолу суюлтулган. Белоктор 12% бис-трис NuPage гелинин көчүрмөсүндө (Thermo Fisher Scientific, Улуу Британия) бөлүнгөн. RC-L суббирдигин жүктөө жана визуалдаштыруу үчүн гель Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Улуу Британия) менен боёлгон. Экинчи гелдеги белок иммуноанализ үчүн метанол менен активдештирилген поливинилиден фторид (PVDF) мембранасына (Thermo Fisher Scientific, Улуу Британия) өткөрүлүп берилген. PVDF мембранасы 50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl, 0.2% (к/к) Tween-20 жана 5% (с/к) майсыздандырылган кургак сүттө бөгөттөлгөн, андан кийин анти-His баштапкы антителосу менен (Dlute the antitelo buffer [50 мМ трис-HCl (рН 7.6), 150 мМ NaCl жана 0.05% (к/к) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, АКШ) 4 саат бою инкубацияланган. Антитело буферинде 5 мүнөт 3 жолу жуугандан кийин, мембрана хрен пероксидазасы (Sigma-Aldrich, Улуу Британия) менен чычканга каршы экинчилик антитело (антитело буферинде 1:10,000 суюлтулган) менен айкалыштырылды. Аныктоо үчүн (антитело буферинде 3 жолу жуугандан кийин 5 мүнөт) WESTAR ETA C 2.0 хемилюминесценция субстратын (Cyanagen, Италия) жана Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Улуу Британия) колдонуп инкубацияланды.
ImageJ (57) программасында ар бир боёлгон гельдин же иммуноанализ тилкесинин интенсивдүүлүгүнүн бөлүштүрүлүшүн чийүү, чокунун астындагы аянтты интеграциялоо жана RC-L (боёлгон гель) менен Protein-W (иммуноанализ) интенсивдүүлүгүнүн катышын эсептөө менен сүрөттү иштетиңиз. Бул катыштар таза RC-LH114-W үлгүсүндөгү RC-Lдин протеин-Wге катышы 1:1 деп болжолдоо жана ошого жараша бүтүндөй маалыматтар топтомун нормалдаштыруу менен молярдык катыштарга айландырылган.
Бул макала боюнча кошумча материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1 дарегинен караңыз.
Бул Creative Commons Attribution лицензиясынын шарттары боюнча таратылган ачык жеткиликтүү макала. Макала түп нускадагы чыгарма туура цитаталанган шартта каалаган каражатта чектөөсүз колдонууга, таратууга жана көчүрүүгө уруксат берет.
Эскертүү: Биз сизден электрондук почта дарегиңизди берүүнү гана суранабыз, ошондо сиз баракчага сунуштаган адам сиз электрондук катты көрүшүн каалаарыңызды жана ал спам эмес экенин билет. Биз эч кандай электрондук почта даректерин кармабайбыз.
Бул суроо сиздин конок экениңизди текшерүү жана спамдын автоматтык түрдө жөнөтүлүшүнүн алдын алуу үчүн колдонулат.
Дэвид Ж.К. Суэйнсбери, Парк Цян, Филип Ж. Джексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Ж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Реакция борборундагы жарык тузак 1 комплексинин жогорку чечилиштеги түзүлүшү хинон динамикасына жаңы түшүнүктөрдү берет.
Дэвид Ж.К. Суэйнсбери, Парк Цян, Филип Ж. Джексон, Кейтлин М. Фэйрис, Дариуш М. Нидзвидзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малон, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Ж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Реакция борборундагы жарык тузак 1 комплексинин жогорку чечилиштеги түзүлүшү хинон динамикасына жаңы түшүнүктөрдү берет.
©2021 Илимди өнүктүрүү боюнча Америка Ассоциациясы. бардык укуктар корголгон. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef жана COUNTERдин өнөктөшү. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.