Учурдагы *Учурдагы дареги: Кёльн 50931, Германия, Кёльндин мыкты кластердик изилдөөсү, картаюуга байланыштуу оорулардагы клеткалык стресске жооп кайтаруу (CECAD).
Митохондриялык оорулардын нейродегенерациясы кайтарылгыс деп эсептелет, анткени нейрондордун метаболикалык пластикалуулугу чектелүү, бирок митохондриялык дисфункциянын организмдеги нейрондук метаболизмдин клеткалык автономиясына тийгизген таасири начар изилденген. Бул жерде биз митохондриялык биригүү динамикасын бузуудан улам пайда болгон прогрессивдүү OXPHOS жетишсиздиги бар Пуркинье нейрондорунун клеткага мүнөздүү протеомасын киргизебиз. Биз митохондриялык дисфункция протеомика тармагында терең өзгөрүүнү пайда кылганын, бул акыры клетканын өлүмүнө чейин так метаболикалык программалардын ырааттуу активдешүүсүнө алып келгенин аныктадык. Күтүлбөгөн жерден, биз пируват карбоксилазанын (PCx) жана TCA циклинин ортоңку продуктуларын толуктаган башка картаюуга каршы ферменттердин айкын индукциясын аныктадык. PCx ингибирлөөсү кычкылдануу стрессин жана нейродегенерацияны күчөттү, бул атеросклероздун OXPHOS жетишпеген нейрондордо коргоочу таасири бар экенин көрсөтүп турат. Терминалдык дегенерацияланган нейрондордо митохондриялык биригүүнү калыбына келтирүү бул метаболикалык мүнөздөмөлөрдү толугу менен жокко чыгарат, ошону менен клеткалардын өлүмүнүн алдын алат. Биздин ачылыштарыбыз митохондриялык дисфункцияга туруктуулукту камсыз кылган мурда белгисиз жолдорду аныктайт жана нейродегенерацияны оорунун акыркы стадияларында да кайтарууга болорун көрсөтөт.
Митохондриянын нейрондук энергия алмашуусун сактоодогу борбордук ролу адамдын митохондриялык оорулары менен байланышкан кеңири неврологиялык симптомдор менен баса белгиленет. Бул оорулардын көпчүлүгү митохондриялык гендердин экспрессиясын жөнгө салуучу ген мутацияларынан (1, 2) же митохондриялык динамикага байланыштуу гендердин бузулушунан келип чыгат, бул митохондриялык ДНКнын (мтДНК) туруктуулугуна кыйыр түрдө таасир этет (3, 4). Жаныбарлардын моделдериндеги иштер айланадагы ткандардагы митохондриялык дисфункцияга жооп катары консервативдик метаболикалык жолдорду (5-7) активдештирүүгө болорун көрсөттү, бул бул татаал оорулардын патогенезин терең түшүнүү үчүн маанилүү маалымат берет. Ал эми мээнин митохондриялык аденозин трифосфатынын (АТФ) өндүрүшүнүн жалпы бузулушунан улам пайда болгон белгилүү бир клетка түрлөрүнүн метаболикалык өзгөрүүлөрүн түшүнүүбүз фундаменталдуу (8) болуп, оорунун алдын алуу же алдын алуу үчүн колдонулушу мүмкүн болгон терапиялык максаттарды аныктоо зарылдыгын баса белгилейт. Нейродегенерациянын алдын алуу (9). Маалыматтын жетишсиздиги нерв клеткаларынын айланадагы ткандардын клетка түрлөрүнө салыштырмалуу метаболикалык ийкемдүүлүгү өтө чектелүү деп кеңири каралгандыгында (10). Бул клеткалар синаптикалык өткөрүүнү күчөтүү жана жаракат алуу жана оору шарттарына жооп берүү үчүн нейрондорго метаболиттерди жеткирүүнү координациялоодо негизги ролду ойногонун эске алганда, клеткалык метаболизмди мээ тканынын татаал шарттарына ылайыкташтыруу жөндөмү дээрлик глиалдык клеткалар менен гана чектелет (11-14). Мындан тышкары, мээ тканынын клеткалык гетерогендүүлүгү белгилүү бир нейрондук топтордо пайда болгон зат алмашуу өзгөрүүлөрүн изилдөөгө чоң тоскоолдук жаратат. Натыйжада, нейрондордогу митохондриялык дисфункциянын так клеткалык жана зат алмашуу кесепеттери жөнүндө аз маалымат белгилүү.
Митохондриялык дисфункциянын зат алмашуу кесепеттерин түшүнүү үчүн, биз митохондриялык сырткы мембрананын биригишинин (Mfn2) бузулушунан келип чыккан нейродегенерациянын ар кандай стадияларындагы Пуркинье нейрондорун (PN) бөлүп алдык. Адамдардагы Mfn2 мутациялары Шаркот-Мари-Тиш 2A түрү (15) деп аталган тукум куучулук мотордук сенсордук нейропатиянын бир түрү менен байланышканы менен, чычкандарда Mfn2нин шарттуу түрдө жок кылынышы кычкылдануунун фосфорлануу (OXPHOS) дисфункциясынын жакшы таанылган индукциясы болуп саналат. Ар кандай нейрондук түрчөлөр (16-19) жана андан келип чыккан нейродегенеративдик фенотип кыймыл бузулуулары (18, 19) же мээче атаксия (16) сыяктуу прогрессивдүү неврологиялык симптомдор менен коштолот. Белгисиз сандык (LFQ) протеомика, метаболомика, сүрөткө тартуу жана вирусологиялык ыкмалардын айкалышын колдонуу менен, биз прогрессивдүү нейродегенерация пируваткарбоксилазаны (PCx) жана PNлердин in vivo артериосклерозуна катышкан башка факторлорду күчтүү индукциялай турганын көрсөтөбүз. Ферменттердин экспрессиясы. Бул ачылыштын актуалдуулугун текшерүү үчүн, биз Mfn2 жетишсиз PN'дерде PCx экспрессиясын атайын төмөндөттүк жана бул операция кычкылдануу стрессин күчөтүп, нейродегенерацияны тездеткенин аныктадык, ошону менен азооспермия клетканын өлүмүнө метаболикалык адаптацияны берерин далилдеди. MFN2нин катуу экспрессиясы OXPHOSтун оор жетишсиздиги, митохондриялык ДНКнын массалык керектелиши жана митохондриялык тармактын бузулушу менен терминалдык дегенерация PNди толугу менен сактап кала алат, бул нейродегенерациянын бул формасы клетканын өлүмүнө чейин оорунун өнүккөн стадиясында да калыбына келе аларын баса белгилейт.
Mfn2 нокаут PNдериндеги митохондрияларды визуалдаштыруу үчүн, биз Cre-көз каранды митохондрияларга сары флуоресценттик белокту (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессиясын бутага алууга мүмкүндүк берген чычкан штаммын колдондук жана митохондриялык морфологияны in vivo текшердик. PNдердеги Mfn2 генинин бузулушу митохондриялык тармактын акырындык менен бөлүнүшүнө алып келерин аныктадык (S1A сүрөтү) жана эң алгачкы өзгөрүү 3 жумалык куракта байкалган. Ал эми, Calbindin иммундук боёгунун жоголушу менен далилденгендей, PN клетка катмарынын олуттуу дегенерациясы 12 жумалык куракка чейин башталган эмес (1-сүрөт, A жана B). Митохондриялык морфологиядагы эң алгачкы өзгөрүүлөр менен нейрондук өлүмдүн көрүнүктүү башталышынын ортосундагы убакыттын дал келбестиги бизди клетка өлүмүнө чейин митохондриялык дисфункциядан улам пайда болгон зат алмашуу өзгөрүүлөрүн изилдөөгө түрткү болду. Биз YFP (YFP+) экспрессиялаган PNди бөлүп алуу үчүн флуоресценция менен активдештирилген клеткаларды сорттоого (FACS) негизделген стратегияны иштеп чыктык (1C-сүрөт) жана контролдук чычкандарда (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), мындан ары CTRL деп аталат (S1B-сүрөт). YFP сигналынын салыштырмалуу интенсивдүүлүгүнө негизделген дарбазалоо стратегиясын оптималдаштыруу бизге YFP+ денесин (YFPhigh) PN эместерден (YFPneg) (S1B-сүрөт) же болжолдуу флуоресценттик аксон/дендриттик фрагменттерден (YFPlow; S1D-сүрөт, солдо) PNдерди тазалоого мүмкүндүк берет, бул конфокалдык микроскоп менен тастыкталат (S1D-сүрөт, оңдо). Классификацияланган популяциянын идентификациясын текшерүү үчүн биз LFQ протеомикасын, андан кийин негизги компоненттик анализди жүргүздүк жана YFPhigh жана YFPneg клеткаларынын ортосунда так бөлүнүү бар экенин аныктадык (S1C-сүрөт). YFPhigh клеткалары белгилүү PN маркерлеринин (б.а. Calb1, Pcp2, Grid2 жана Itpr3) таза байытылганын көрсөттү (21, 22), бирок нейрондордо же башка клетка түрлөрүндө көп кездешкен белоктордун байытылганы байкалган жок (1D-сүрөт). Көз карандысыз эксперименттерде чогултулган классификацияланган YFPhigh клеткаларындагы үлгүлөрдү салыштыруу корреляция коэффициенти > 0,9 экенин көрсөттү, бул биологиялык репликалардын ортосунда жакшы кайталануучулукту көрсөттү (S1E-сүрөт). Кыскача айтканда, бул маалыматтар мүмкүн болгон PNди курч жана спецификалык бөлүп алуу планыбызды тастыктады. Колдонулган L7-cre драйвер системасы төрөттөн кийинки биринчи жумада мозаикалык рекомбинацияны индукциялагандыктан (23), биз CTRLден чычкандарды жок кыла баштадык жана шарттуу (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) нейрондорду чогулттук. Рекомбинация аяктагандан кийин, ал 4 жумалык курагында Mfn2cKO деп аталат. Акыркы чекит катары биз митохондриялык фрагментацияга карабастан, PN катмары бүтүн бойдон калган 8 жумалык жашты тандап алдык (1B-сүрөт жана S1A-сүрөт). Жалпысынан биз 3013 белокту сандык жактан аныктадык, алардын ичинен болжол менен 22% митохондриялык протеомду митохондрия катары колдонууга негизделген MitoCarta 2.0 аннотацияларына негизделген (1E-сүрөт) (1E-сүрөт) (24). 8-жумада жүргүзүлгөн дифференциалдык ген экспрессиясынын анализи бардык белоктордун 10,5% гана олуттуу өзгөрүүлөргө дуушар болгонун көрсөттү (1F-сүрөт жана S1F-сүрөт), алардын ичинен 195 белок төмөндөтүлгөн жана 120 белок жогорулатылган (1F-сүрөт). Белгилей кетүүчү нерсе, бул маалыматтар топтомунун "инновациялык жол анализи" дифференциалдык түрдө экспрессияланган гендер негизинен белгилүү бир зат алмашуу жолдорунун чектелген жыйындысына таандык экенин көрсөтөт (1G-сүрөт). Кызыктуусу, OXPHOS жана кальций сигнализациясына байланыштуу жолдордун төмөндөшү биригүү жетишсиз PNлерде митохондриялык дисфункциянын индукциясын тастыктаса да, негизинен аминокислоталардын алмашуусун камтыган башка категориялар бир кыйла жогорулаган, бул митохондриялык PNлерде пайда болгон метаболизмге дал келет. Кайра зымдоо ырааттуу түрдө бузулат.
(A) CTRL жана Mfn2cKO чычкандарынын мээче кесилиштеринин репрезентативдик конфокалдык сүрөттөрү PNдердин (кальбиндин, боз) прогрессивдүү жоголушун көрсөтөт; ядролор DAPI менен карама-каршы боёлгон. (B) (A) сандык аныктоо (дисперсиянын бир тараптуу анализи, ***P<0.001; n = үч чычкандан 4төн 6га чейинки тегерекчелер). (C) Эксперименталдык жумуш агымы. (D) Пуркиньеге (үстүнкү) жана башка клетка түрлөрүнө (ортодо) мүнөздүү маркерлердин жылуулук картасынын бөлүштүрүлүшү. (E) Классификацияланган PNде аныкталган митохондриялык белоктордун санын көрсөткөн Венн диаграммасы. (F) 8 жумада Mfn2cKO нейрондорундагы дифференциалдуу экспрессияланган белоктордун жанар тоо графиги (маанилүүлүктүн чектик мааниси 1,3). (G) Чыгармачылык жолунун анализи 8 жума катары классификацияланган Mfn2cKO PNдеги эң маанилүү беш жогорулоо (кызыл) жана төмөндөө (көк) жолдорун көрсөтөт. Ар бир аныкталган белоктун орточо экспрессия деңгээли көрсөтүлгөн. Боз түстөгү жылуулук картасы: туураланган P мааниси. нс, маанилүү эмес.
Протеомика маалыматтары I, III жана IV комплекстеринин белок экспрессиясы акырындык менен төмөндөгөнүн көрсөттү. I, III жана IV комплекстеринин бардыгында маанилүү мтДНК менен коддолгон суббирдиктер бар болчу, ал эми ядролук коддолгон II комплекске дээрлик таасир эткен жок (2A-сүрөт жана S2A-сүрөт). . Протеомиканын жыйынтыктарына ылайык, мээче тканынын кесилиштеринин иммуногистохимиясы PNдеги IV комплекстин MTCO1 (митохондриялык цитохром С оксидаза суббирдиги 1) суббирдигинин деңгээли акырындык менен төмөндөгөнүн көрсөттү (2B-сүрөт). мтДНК менен коддолгон Mtatp8 суббирдиги бир кыйла төмөндөгөн (S2A-сүрөт), ал эми ядролук коддолгон АТФ синтаза суббирдигинин туруктуу абалы өзгөрүүсүз калган, бул мтДНК экспрессиясы туруктуу болгондо белгилүү туруктуу АТФ синтаза субжыйны F1 комплексине дал келет. Түзүлүшү ырааттуу. Үзгүлтүккө учуратуу (7). Сорттолгон Mfn2cKO PNдериндеги мтДНК деңгээлин реалдуу убакыттагы полимераз чынжыр реакциясы (qPCR) менен баалоо мтДНК көчүрмөсүнүн санынын акырындык менен төмөндөшүн тастыктады. Контролдук топ менен салыштырганда, 8 жумалык куракта мтДНК деңгээлинин болжол менен 20% гана сакталып калган (2C-сүрөт). Бул жыйынтыктарга ылайык, ДНКны аныктоо үчүн Mfn2cKO PNдеринин конфокалдык микроскопиялык боёгу колдонулган, бул митохондриялык нуклеотиддердин убакытка көз каранды керектөөсүн көрсөткөн (2D-сүрөт). Биз митохондриялык белоктун деградациясына жана стресстик реакцияга катышкан айрым кандидаттар гана жогорулаганын, анын ичинде Lonp1, Afg3l2 жана Clpx жана OXPHOS комплексинин жыйынды факторлору жогорулаганын аныктадык. Апоптозго катышкан белоктордун деңгээлинде эч кандай олуттуу өзгөрүүлөр аныкталган жок (S2B-сүрөт). Ошо сыяктуу эле, кальцийди ташууга катышкан митохондриялар жана эндоплазмалык торчо каналдары анча чоң эмес өзгөрүүлөргө гана ээ экенин аныктадык (S2C-сүрөт). Мындан тышкары, аутофагияга байланыштуу белокторду баалоодо эч кандай олуттуу өзгөрүүлөр табылган жок, бул иммуногистохимия жана электрондук микроскопия аркылуу in vivo байкалган аутофагосомалардын көрүнүктүү индукциясына дал келет (S3-сүрөт). Бирок, PNдеги прогрессивдүү OXPHOS дисфункциясы ачык ультраструктуралык митохондриялык өзгөрүүлөр менен коштолот. Митохондриялык кластерлерди 5 жана 8 жумалык Mfn2cKO PNдердин клетка денелеринде жана дендриттик дарактарында көрүүгө болот, ал эми ички мембрана түзүлүшү терең өзгөрүүлөргө дуушар болгон (S4, A жана B-сүрөттөр). Бул ультраструктуралык өзгөрүүлөргө жана мтДНКнын олуттуу төмөндөшүнө ылайык, курч мээ мээчечесинин кесимдерин тетраметилродамин метил эфири (TMRM) менен талдоо Mfn2cKO PNдериндеги митохондриялык мембрана потенциалы бир кыйла төмөндөгөнүн көрсөттү (S4C-сүрөт).
(A) OXPHOS комплексинин экспрессия деңгээлинин убакыт курсу боюнча анализи. 8 жумада P<0.05 болгон белокторду гана карап көрүңүз (эки тараптуу ANOVA). Чекиттүү сызык: CTRL менен салыштырганда эч кандай түзөтүү жок. (B) Сол жакта: MTCO1ге каршы антитело менен белгиленген мээче кесилишинин мисалы (масштаб тилкеси, 20 мкм). Пуркинье клетка денечелери ээлеген аянт сары түс менен капталган. Оң жакта: MTCO1 деңгээлин сандык аныктоо (дисперсиянын бир тараптуу анализи; үч чычкандан алынган n = 7ден 20га чейинки клеткалар талданган). (C) сорттолгон PNдеги mtDNA көчүрмөсүнүн санынын qPCR анализи (дисперсиянын бир тараптуу анализи; n = 3төн 7ге чейинки чычкандар). (D) Сол жакта: ДНКга каршы антитело менен белгиленген мээче кесилишинин мисалы (масштаб тилкеси, 20 мкм). Пуркинье клетка денечелери ээлеген аянт сары түс менен капталган. Оң жакта: мтДНК жабыркоолорунун сандык көрсөткүчү (дисперсиянын бир тараптуу анализи; n = үч чычкандан 5тен 9га чейинки клеткалар). (E) Бүтүндөй клеткалык патч кыскычынын жаздыруусунда митоYFP + Пуркинье клеткаларын көрсөткөн курч мээче кесилишинин мисалы (жебе). (F) IV ийри сызыгынын сандык көрсөткүчү. (G) CTRL жана Mfn2cKO Пуркинье клеткаларына деполяризациялоочу токтун инъекциясынын типтүү жаздыруулары. Үстүнкү из: APди иштеткен биринчи импульс. Төмөнкү из: APнин максималдуу жыштыгы. (H) Постсинаптикалык стихиялуу киргизүүлөрдүн (sPSP) сандык көрсөткүчү. Өкүлчүлүктүү жаздыруу изи жана анын масштабдоо катышы (I) сүрөтүндө көрсөтүлгөн. Үч чычкандан n = 5тен 20га чейинки клеткаларда талданган дисперсиянын бир тараптуу анализи. Маалыматтар орточо ± SEM катары көрсөтүлөт; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Перфорацияланган патч кыскыч режимин колдонуу менен жазылган стихиялуу APнин типтүү издери. Үстүнкү из: APнин максималдуу жыштыгы. Төмөнкү из: бир APнин масштабдоосу. (K) Орточо жана максималдуу AP жыштыгын (J) боюнча сандык жактан аныктаңыз. Манн-Уитни тести; төрт чычкандан алынган n = 5 клетка талданган. Маалыматтар орточо ± SEM катары көрсөтүлөт; маанилүү эмес.
8 жумалык Mfn2cKO PNде OXPHOSтун ачык бузулушу аныкталган, бул нейрондордун физиологиялык функциясынын өтө анормалдуу экенин көрсөтүп турат. Ошондуктан, биз курч мээче кесимдеринде бүт клеткалуу патч кыскычтарын жаздыруу менен 4-5 жумада жана 7-8 жумада OXPHOS жетишсиз нейрондордун пассивдүү электрдик мүнөздөмөлөрүн талдадык (2E-сүрөт). Күтүлбөгөн жерден, Mfn2cKO нейрондорунун орточо эс алуу мембранасынын потенциалы жана киргизүү каршылыгы контролдук топко окшош болгон, бирок клеткалардын ортосунда анча чоң эмес айырмачылыктар болгон (1-таблица). Ошо сыяктуу эле, 4-5 жумалык куракта ток-чыңалуу байланышында (IV ийри сызыгы) эч кандай олуттуу өзгөрүүлөр табылган жок (2F-сүрөт). Бирок, 7-8 жумалык Mfn2cKO нейрондору IV режиминен (гиперполяризация этабы) аман калган эмес, бул акыркы этапта гиперполяризация потенциалына айкын сезгичтик бар экенин көрсөтүп турат. Ал эми, Mfn2cKO нейрондорунда кайталануучу аракет потенциалынын (AP) разряддарын пайда кылган деполяризациялоочу токтор жакшы көтөрүмдүүлүккө ээ, бул алардын жалпы разряд үлгүлөрү 8 жумалык контролдук нейрондордукунан анчалык деле айырмаланбай турганын көрсөтүп турат (1-таблица жана 2G-сүрөт). Ошо сыяктуу эле, спонтандык постсинаптикалык токтордун (sPSC) жыштыгы жана амплитудасы контролдук топтуку менен салыштырууга болот жана окуялардын жыштыгы 4 жумадан 5 жумага чейин, 7 жумадан 8 жумага чейин көбөйүп, окшош көбөйүү менен (2-сүрөт, H жана I). PNдеги синаптикалык жетилүү мезгили (25). Тешилген PN патчтарынан кийин окшош натыйжалар алынган. Бул конфигурация клеткалык АТФ кемчиликтеринин мүмкүн болгон компенсациясына жол бербейт, бул бүт клеткалык патч кыскычын жаздырууда болушу мүмкүн. Атап айтканда, Mfn2cKO нейрондорунун эс алуу мембранасынын потенциалы жана спонтандык атылуу жыштыгы жабыркаган эмес (2-сүрөт, J жана K). Кыскача айтканда, бул жыйынтыктар OXPHOS дисфункциясы айкын болгон PNлер жогорку жыштыктагы разряддык үлгүлөргө жакшы туруштук бере аларын көрсөтүп турат, бул аларга дээрлик нормалдуу электрофизиологиялык жоопторду сактоого мүмкүндүк берген компенсация механизми бар экенин көрсөтүп турат.
Маалыматтар орточо ± SEM (дисперсиянын бир тараптуу анализи, Холм-Сидактын көптүк салыштыруу тести; *P<0.05) катары көрсөтүлөт. Бирдиктин номери кашаанын ичинде көрсөтүлөт.
Биз протеомика маалыматтар топтомундагы кайсы бир категорияда (1G-сүрөт) OXPHOSтун оор жетишсиздигине каршы тура турган жолдор бар же жок экенин изилдөөнү максат кылдык, ошону менен жабыркаган ПН эмне үчүн дээрлик нормалдуу электрофизиологияны сактай аларын түшүндүрдү (2-сүрөт, Eден Kге чейин). . Протеомика анализи тармакталган чынжырлуу аминокислоталардын (BCAA) катаболизмине катышкан ферменттердин бир кыйла жогорулаганын көрсөттү (3A-сүрөт жана S5A-сүрөт) жана акыркы продукт ацетил-КоА (CoA) же сукцинил КоА артериосклероз кислотасынын (TCA) циклиндеги трикарбоксилаттарды толуктай алат. Биз BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) жана BCAT2нин курамы жогорулаганын аныктадык. Алар α-кетоглютараттан глутаматты пайда кылуу менен BCAA катаболизминин биринчи этабын катализдейт (26). Бутактанган чынжырлуу кето кислота дегидрогеназа (BCKD) комплексин түзгөн бардык суббирдиктер жогорулатылган (комплекс пайда болгон BCAA көмүртек скелетинин кийинки жана кайтарылгыс декарбоксилденүүсүн катализдейт) (3A-сүрөт жана S5A-сүрөт). Бирок, сорттолгон PNде BCAAнын өзүндө эч кандай айкын өзгөрүүлөр табылган жок, бул бул маанилүү аминокислоталардын клеткалык сиңирилишинин жогорулашына же TCA циклин толуктоо үчүн башка булактарды (глюкоза же сүт кислотасы) колдонууга байланыштуу болушу мүмкүн (S5B-сүрөт). OXPHOS жетишсиз PNдерде 8 жумалык куракта глутаминдин ажыроо жана трансаминация активдүүлүгү жогорулаган, бул митохондриялык ферменттердин глутаминаза (GLS) жана глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) жогорулашы менен чагылдырылышы мүмкүн (3-сүрөт, A жана C). Белгилей кетүүчү нерсе, GLSтин жогорулашы глутаминаза С изоформасы (GLS-GAC) менен гана чектелет (Mfn2cKO/CTRLдин өзгөрүшү болжол менен 4,5 эсе, P = 0,05) жана анын рак ткандарындагы өзгөчө жогорулашы митохондриялык биоэнергияны колдой алат (27).
(A) Жылуулук картасы 8 жумада көрсөтүлгөн маршрут боюнча белок деңгээлинин бүктөлүшүнүн өзгөрүшүн көрсөтөт. (B) PCx антителосуна каршы антитело менен белгиленген мээче кесиминин мисалы (масштаб тилкеси, 20 мкм). Сары жебе Пуркинье клеткасынын денесине көрсөтүп турат. (C) Атеросклероз үчүн маанилүү талапкер катары аныкталган убакыт курсунун белок экспрессиясын талдоо (бир нече t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 чычкан). (D) Жогоруда: [1-13C]пируват индикаторунда камтылган белгиленген көмүртекти киргизүүнүн ар кандай жолдорун көрсөткөн схемалык диаграмма (б.а., PDH же транс-артериялык маршрут аркылуу). Төмөндө: Скрипка диаграммасында курч мээче кесимдери [1-13C]пируват менен белгиленгенден кийин аспарагин кислотасына, лимон кислотасына жана алма кислотасына айландырылган бир белгиленген көмүртектин (M1) пайызы көрсөтүлгөн (жупташкан t-тест; ** P <0.01). (E) Көрсөтүлгөн жолдун комплекстүү убакыт тарыхын талдоо. 8 жумада P<0,05 болгон белокторду гана эске алыңыз. Үзүк сызык: түзөтүү мааниси жок (дисперсиянын эки тараптуу анализи; * P <0,05; *** P <0,001). Маалыматтар орточо ± SEM катары көрсөтүлөт.
Биздин анализибизде BCAA катаболизми негизги жогорулоо жолдорунун бирине айланды. Бул факт OXPHOS жетишпеген PNде TCA циклине кирген желдетүү көлөмү өзгөрүшү мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Бул нейрондордун метаболикалык кайра зымдоосунун негизги формасын көрсөтүшү мүмкүн, ал OXPHOSтун оор дисфункциясын сактоо учурунда нейрондордун физиологиясына жана жашоого түздөн-түз таасир этиши мүмкүн. Бул гипотезага ылайык, биз негизги антиатеросклероздук фермент PCx жогорулоодо экенин аныктадык (Mfn2cKO/CTRL болжол менен 1,5 эсе өзгөрөт; 3A-сүрөт), бул пируваттын оксалоацетаттын айлануусун катализдейт (28), ал мээ тканында деп эсептелет. экспрессиясы астроциттер менен гана чектелген (29, 30). Протеомиканын жыйынтыктарына ылайык, конфокалдык микроскопия PCx экспрессиясы OXPHOS жетишсиз PNлерде өзгөчө жана олуттуу жогорулаганын, ал эми PCx реактивдүүлүгү негизинен контролдун жакынкы Бергман глиалдык клеткалары менен гана чектелгенин көрсөттү (3B-сүрөт). PCxтин байкалган жогорулашын функционалдык жактан текшерүү үчүн, биз курч мээче кесимдерин [1-13C]пируват индикатору менен дарыладык. Пируват пируватдегидрогеназа (PDH) менен кычкылданганда, анын изотоптук этикеткасы жоголуп, бирок пируват кан тамыр реакциялары аркылуу метаболизденгенде TCA циклинин аралык продуктуларына кошулат (3D-сүрөт). Протеомика маалыматтарыбызды колдоо үчүн, биз Mfn2cKO кесимдеринин аспарагин кислотасында бул индикатордон көп сандаган маркерлерди байкадык, ал эми лимон кислотасы жана алма кислотасы да орточо тенденцияга ээ болду, бирок олуттуу эмес (3D-сүрөт).
МитоПарк чычкандарынын дофамин нейрондорунун митохондриялык транскрипция фактору А генин (Tfam) атайын жок кылуусунан улам пайда болгон митохондриялык дисфункциясы бар дофамин нейрондорунда (S6B сүрөт) PCx экспрессиясы да бир кыйла жогорулаган (31), бул ацетон кислотасынын артериосклерозун көрсөтүп турат. Оорунун пайда болушу организмдеги нейрондук OXPHOSтун дисфункциясы учурунда жөнгө салынат. Белгилей кетүүчү нерсе, артериосклероз менен байланышкан нейрондордо экспрессияланышы мүмкүн болгон уникалдуу ферменттер (32-34) OXPHOS жетишпеген PNлерде, мисалы, пропионил-КоА карбоксилазасында (PCC-A), малонил-КоА пропионил-КоАны сукцинил-КоАга айландырат жана митохондриялык алма ферменти 3 (ME3), анын негизги ролу пируватты малаттан калыбына келтирүү (3-сүрөт, A жана C) (33, 35) бир кыйла жогорулаган. Мындан тышкары, биз Pdk3 ферментинин олуттуу көбөйүшүн байкадык, ал фосфорлоп, ошентип PDHди активдештирбейт (36), ал эми PDHди активдештирүүчү Pdp1 ферментинде же PDH фермент комплексинин өзүндө эч кандай өзгөрүүлөр аныкталган жок (3A-сүрөт). Mern2cKO PNдеринде Ser293төгү PDH комплексинин пируватдегидрогеназа E1 компонентинин α1 суббирдиги α (PDHE1α) суббирдигинин фосфорлошуусу (PDH ферменттик активдүүлүгүн басаңдатары белгилүү) күчөгөн (S6C-сүрөт) (S6C-сүрөт). Пируваттын кан тамырларга жетүү мүмкүнчүлүгү жок.
Акырында, биз серин жана глицин биосинтезинин супер жолу, тиешелүү митохондриялык фолат (1C) цикли жана пролин биосинтези (1G жана S5C сүрөттөрү) активдешүү процессинде бир кыйла жогорулаганын аныктадык. Айланадагы ткандар митохондриялык дисфункция менен активдешет (5-7). Бул протеомика маалыматтарын колдогон конфокалдык анализ OXPHOS жок PNде 8 жумалык чычкандардын мээче кесимдери митохондриялык фолат циклинин негизги ферменти болгон серин гидроксиметилтрансфераза 2ге (SHMT2) дуушар болгонун көрсөттү. Олуттуу иммундук жооп (S5D сүрөтү). 13 CU-глюкоза менен инкубацияланган курч мээче кесимдеринде метаболикалык байкоо эксперименттери серин жана пролин биосинтезинин жогорулаганын дагы бир жолу тастыктады, бул көмүртек изоформаларынын серинге жана пролинге агымы жогорулаганын көрсөтүп турат (S5E сүрөтү). GLS жана GPT2 тарабынан күчөтүлгөн реакциялар глутаминден глутаматтын синтези жана глутамат менен α-кетоглутараттын ортосундагы трансаминация үчүн жооптуу болгондуктан, алардын жогорулашы OXPHOS жетишсиз нейрондордо глутаматка болгон суроо-талаптын жогорулаганын көрсөтүп турат. Бул пролиндин көбөйгөн биосинтезин сактоого багытталган болушу мүмкүн (S5C-сүрөт). Бул өзгөрүүлөрдөн айырмаланып, PNге мүнөздүү Mfn2cKO чычкандарынан алынган мээчече астроциттеринин протеомикалык анализи бул жолдордун (бардык антипероксидазаларды кошо алганда) экспрессиясында олуттуу өзгөргөн эместигин көрсөттү, бул зат алмашуунун кайра багыттоосу бузулган PNге селективдүү экенин көрсөтөт (S6-сүрөт, Dден Gге чейин).
Кыскача айтканда, бул анализдер ПНдеги белгилүү бир зат алмашуу жолдорунун убактылуу активдешүүсүнүн бир топ айырмаланган үлгүлөрүн аныктады. Нейрондордун митохондриялык функциясынын анормалдуулугу атеросклероздун эрте башталышына жана 1C ремоделизациясына (3E-сүрөт жана S5C-сүрөт), ал тургай I жана IV комплекстеринин экспрессиясындагы алдын ала айтууга боло турган өзгөрүүлөргө алып келиши мүмкүн болсо да, серин де ново синтезиндеги өзгөрүүлөр гана акыркы стадияларда гана байкала баштады. OXPHOS дисфункциясы (3E-сүрөт жана S5C-сүрөт). Бул ачылыштар стресстен улам пайда болгон митохондриялык (1C цикли) жана цитоплазмалык (серин биосинтези) TCA циклиндеги атеросклероздун көбөйүшү менен синергетикалык түрдө нейрондук метаболизмди өзгөртүү үчүн жооп берген ырааттуу процессти аныктайт.
8 жумалык OXPHOS жетишсиз PNдери жогорку жыштыктагы козголуу активдүүлүгүн сактап, митохондриялык дисфункцияны компенсациялоо үчүн олуттуу метаболикалык кайра байланышка өтө алышат. Бул ачылыш ушул учурда да бул клеткалар нейродегенерацияны кечеңдетүү же алдын алуу үчүн терапиялык кийлигишүүнү алышы мүмкүн деген кызыктуу мүмкүнчүлүктү жаратат. Кеч. Биз бул мүмкүнчүлүктү эки көз карандысыз кийлигишүү аркылуу чечтик. Биринчи ыкмада биз Cre-көз каранды адено-байланыштуу вирус (AAV) векторун иштеп чыктык, ошондуктан MFN2 in vivo OXPHOS жетишсиз PNдерде тандалма түрдө экспрессияланышы мүмкүн (S7A-сүрөт). MFN2 коддогон AAV жана флуоресценттик репортер гени mCherry (Mfn2-AAV) in vitro баштапкы нейрон культураларында текшерилген, бул MFN2нин Cre-көз каранды түрдө экспрессияланышына алып келген жана митохондриялык морфологияны сактап калган, ошону менен Mfn2cKO нейрондорунда нейромутациянын алдын алган (S7, B, D жана E-сүрөттөр). Андан кийин, биз 8 жумалык Mfn2-AAVды Mfn2cKO жана контролдук чычкандардын мээче кабыгына стереотактикалык жеткирүү үчүн in vivo эксперименттерин жүргүздүк жана 12 жумалык чычкандарды талдадык (4A-сүрөт). Дарыланган Mfn2cKO чычкандары өлүп калган (1-сүрөт, A жана B) (16). In vivo вирустук трансдукция кээ бир мээче тегерекчелеринде PNдин тандалма экспрессиясына алып келген (S7, G жана H-сүрөт). mCherryди гана экспрессиялаган контролдук AAV (Ctrl-AAV) сайылышы Mfn2cKO жаныбарларында нейродегенерация даражасына эч кандай олуттуу таасир эткен эмес. Ал эми, Mfn2-AAV менен трансдукцияланган Mfn2cKOлорду талдоо PN клетка катмарынын олуттуу коргоочу таасирин көрсөттү (4-сүрөт, B жана C). Атап айтканда, нейрон тыгыздыгы контролдук жаныбарлардан дээрлик айырмаланбайт окшойт (4-сүрөт, B жана C, жана S7, H жана I-сүрөт). MFN1 экспрессиясы, бирок MFN2 эмес, нейрондордун өлүмүн сактап калууда бирдей натыйжалуу (4C-сүрөт жана S7, C жана F-сүрөттөр), бул эктопиялык MFN1 экспрессиясы MFN2нин жетишсиздигин натыйжалуу толуктай аларын көрсөтүп турат. Бир PN деңгээлиндеги андан аркы талдоо Mfn2-AAV митохондриялардын ультрастурумун негизинен сактап калганын, мтДНКнын деңгээлин нормалдаштырганын жана ангиогенезге каршы маркер PCxтин жогорку экспрессиясын калыбына келтиргенин көрсөттү (4-сүрөт, Cден Eге чейин). Куткарылган Mfn2cKO чычкандарын эс алуу абалында визуалдык текшерүү алардын абалы жана кыймыл симптомдору (S1ден S3кө чейинки кыймыл) жакшырганын көрсөттү. Жыйынтыктап айтканда, бул эксперименттер OXPHOSто олуттуу жетишсиздик болгон PNге MFN2нин кечиктирилген кайра киргизилиши мтДНКнын керектөөсүн калыбына келтирүү жана атеросклерозду пайда кылуу үчүн жетиштүү экенин, ошону менен аксон дегенерациясынын жана нейрондордун өлүмүнүн in vivo алдын алаарын көрсөтүп турат.
(A) Көрсөтүлгөн зат алмашуу жолу активдештирилгенде MFN2 коддоочу AAV сайуунун эксперименталдык графигин көрсөткөн схема. (B) 8 жумада Mfn2cKO чычкандарында трансдукцияланган жана Кальбиндинге каршы антитело менен белгиленген 12 жумалык мээче кесимдеринин типтүү конфокалдык сүрөттөрү. Оң жакта: Аксон жипчелеринин масштабы. Аксон зумунун масштабы 450 жана 75 мкм. (C) Сол жакта: AAV трансдукция циклиндеги (AAV+) Пуркинье клеткасынын тыгыздыгын сандык аныктоо (дисперсиянын бир тараптуу анализи; n = 3 чычкан). Оң жакта: 12-жумада трансдукцияланган PNдеги мтДНКнын фокустук анализи (жупташпаган t-тест; үч чычкандан n = 6 клетка). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Көрсөтүлгөн вирустук векторлор менен трансдукцияланган Mfn2cKO мээче кесимдеринин PNлеринин типтүү трансмиссиялык электрондук микрографиялары. Кызгылт маска дендриттер ээлеген аянтты, ал эми сары чекиттүү төрт бурчтук оң жакта берилген масштабды көрсөтөт; n ядрону билдирет. Масштаб тилкеси, 1 мкм. (E) 12 жумада PNде трансдукцияланган PCx боёгунун мисалын көрсөтөт. Масштаб тилкеси, 20 мкм. OE, ашыкча экспрессия; FC, бүктөмдүн өзгөрүшү.
Акырында, биз OXPHOS дисфункциясын башынан өткөргөн PNлерде пероксидаза менен индукцияланган клеткалардын жашоо деңгээлинин маанисин изилдедик. Биз чычкандын PCx mRNAсын (AAV-shPCx) атайын бутага алган AAV-shRNA (кыска чачтуу РНК) коддогон mCherry түздүк жана вирусту же анын аралаштырылган контролун (AAV-scr) Mfn2cKO чычкандарынын мээчесине сайдык. Инъекция төртүнчү жумада (5A-сүрөт) PCx экспрессиясы жогорулаган (3C-сүрөт) жана PN клетка катмары дагы эле бүтүн болгон мезгилде PCxти натыйжалуу нокаунд кылуу үчүн жасалган (1A-сүрөт). Белгилей кетүүчү нерсе, PCxти нокаунддоо (S8A-сүрөт) PN өлүмүнүн олуттуу тездешине алып келет, ал инфекцияланган шакек менен гана чектелет (5, B жана C-сүрөттөр). PCx жогорулашынан улам пайда болгон зат алмашуу эффекттеринин механизмин түшүнүү үчүн, биз глутатионду баалоо үчүн PCx нокдауну жана AAV аркылуу оптикалык биосенсор Grx1-roGFP2 бир убакта экспрессиялангандан кийинки PNдердин кычкылдануу-калыбына келүү абалын изилдедик (S8-сүрөт, B дан D га чейин). Андан кийин, FLIM шарттарын текшергенден кийин цитоплазмалык кычкылдануу-калыбына келүү абалындагы потенциалдуу өзгөрүүлөрдү аныктоо үчүн 7 жумалык Mfn2cKO же контролдук батирлештердин курч мээ кесимдеринде эки фотондук флуоресценциялык өмүр бою сүрөткө тартуу микроскопиясын (FLIM) жүргүздүк (S8-сүрөт, E дан G га чейин). Анализ PCx экспрессиясы жок бир Mfn2cKO PNдердин кычкылдануу абалынын олуттуу жогорулаганын көрсөттү, бул контролдук нейрондордон же аралаштырылган shRNAны гана экспрессиялаган Mfn2cKO PNдеринен айырмаланат (5-сүрөт, D жана E). PCx экспрессиясы төмөндөгөндө, жогорку кычкылдануу абалын көрсөткөн Mfn2cKO PNдердин пайызы үч эседен ашык көбөйгөн (5E-сүрөт), бул PCxтин жогорулашы дегенерацияланган нейрондордун кычкылдануу-калыбына келүү жөндөмүн сактап калганын көрсөтүп турат.
(A) Көрсөтүлгөн зат алмашуу жолу активдештирилгенде shPCx коддоочу AAV сайуунун эксперименталдык графигин көрсөткөн схема. (B) 4 жумада кальциневринге каршы антитело менен трансдукцияланган жана белгиленген Mfn2cKO чычкандарынын 8 жумалык мээче кесилиштеринин типтүү конфокалдык сүрөттөрү. Масштаб тилкеси, 450 мкм. (C) AAV трансдукцияланган циклдердеги Пуркинье клеткасынын тыгыздыгын сандык аныктоо (дисперсиянын бир тараптуу анализи; n = 3төн 4кө чейин чычкан). Маалыматтар орточо ± SEM катары көрсөтүлөт; ***P<0.001. (D) ТИПтүү FLIM сүрөтү көрсөтүлгөн эксперименталдык шарттарда 7 жумалык PN экспрессиялаган глутатион кычкылдануу-калыбына келүү сенсору Grx1-roGFP2нин орточо жашоо узактыгын көрсөтөт. LUT (издөө таблицасы) катышы: жашоо убактысынын аралыгы (пикосекунддарда). Масштаб тилкеси, 25 мкм. (E) Гистограммада (D) (ар бир шартта эки чычкандагы n=158ден 368ге чейинки клеткалар) Grx1-roGFP2 жашоо мөөнөтүнүн маанилеринин бөлүштүрүлүшү көрсөтүлгөн. Ар бир гистограмманын үстүндөгү тегерек диаграмма: CTRL-AAV-scrдеги орточо жашоо мөөнөтүнүн маанисинен 1 SD ашкан, бир топ узунураак (кызыл, кычкылданган) же кыскараак (көк, кыскарган) жашоо мөөнөтүнүн маанилери бар клеткалардын саны көрсөтүлгөн. (F) Сунушталган модель нейрондук PCxтин жогорулашынын коргоочу таасирин көрсөтөт.
Жалпысынан алганда, биз бул жерде берген маалыматтар MFN2нин кайра экспрессиясы OXPHOSтун оор жетишсиздиги, мтДНКнын оор азайышы жана өтө анормалдуу иста сымал морфологиясы бар өнүккөн ПНди толугу менен сактап кала аларын, ошону менен өнүккөн ооруларда да үзгүлтүксүз прогрессти камсыз кыла аларын көрсөтүп турат. Нейродегенерация клетканын өлүмүнө чейинки стадиянын кайтарылгыс далилдерин берет. Зат алмашуунун бул даражасы нейрондордун атеросклерозду (TCA циклинин кайра туташуусу) пайда кылуу жөндөмү менен дагы баса белгиленет, ал OXPHOS жок ПНдерде PCx экспрессиясын басаңдатат жана клетканын өлүмүн күчөтөт, ошону менен коргоочу ролду ойнойт (5F-сүрөт).
Бул изилдөөдө биз PNлердин OXPHOS дисфункциясына реакциясы метаболикалык программалар тарабынан активдештирилген дифференциалдык активация жолу аркылуу акырындык менен TCA циклинин атеросклерозуна жакындашы экенин далилдедик. Биз протеомикалык анализди көптөгөн кошумча ыкмалар менен тастыктадык жана митохондриялык катуу дисфункцияга дуушар болгондо, нейрондор мурда белгисиз болгон метаболикалык ийкемдүүлүккө ээ экенин аныктадык. Бизди таң калтырганы, бүтүндөй кайра зымдоо процесси нейродегенерация менен акырындык менен жана кайтарылгыс түрдө коштолгон терминалдык метаболикалык абалды белгилебейт, бирок биздин маалыматтар анын клетканын өлүмүнө чейинки этапта да колдоочу нейронду түзүшү мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Функционалдык компенсация механизми. Бул ачылыш нейрондордун организмде бир топ деңгээлде метаболикалык пластикалуулугу бар экенин көрсөтүп турат. Бул факт MFN2нин кийинчерээк кайра киргизилиши негизги метаболикалык маркерлердин экспрессиясын жокко чыгарып, PN дегенерациясынын алдын ала аларын далилдейт. Тескерисинче, ал атеросклерозду басаңдатат жана нервдерди тездетет. транссексуал.
Биздин изилдөөбүздөгү эң кызыктуу ачылыштардын бири - OXPHOS жетишпеген PNлер атеросклерозду атайын стимулдаган ферменттерди жогорулатуу менен TCA циклинин метаболизмин өзгөртө алат. Метаболикалык кайра түзүлүш рак клеткаларынын кеңири таралган өзгөчөлүгү болуп саналат, алардын айрымдары дем алуу чынжырын кыймылдатып, липиддик жана нуклеотиддик биосинтез прекурсорлорунун өндүрүшүн сактап калуучу калыбына келтирүүчү эквиваленттерди өндүрүү үчүн TCA циклинин аралык продуктуларын толуктоо үчүн глутаминге таянат (39, 40). Жакында жүргүзүлгөн бир изилдөө OXPHOS дисфункциясын башынан өткөргөн перифериялык ткандарда глутамин/глутамат метаболизминин кайра туташуусу да маанилүү өзгөчөлүк экенин көрсөттү (5, 41), мында глутаминдин TCA циклине кирүү багыты OXPHOS жаракатынын оордугунан көз каранды (41). Бирок, денедеги нейрондук метаболикалык пластикалуулуктун кандайдыр бир окшоштугу жана анын оору контекстиндеги мүмкүн болгон мааниси жөнүндө так далилдер жок. Жакында жүргүзүлгөн in vitro изилдөөдө баштапкы кортикалдык нейрондор нейротрансмиссия үчүн глутамат пулдарын мобилизациялай турганы, ошону менен метаболикалык стресс шарттарында кычкылдануу метаболизмин жана атеросклерозду күчөтөрү көрсөтүлдү (42). Белгилей кетүүчү нерсе, TCA циклинин ферменти сукцинатдегидрогеназанын фармакологиялык ингибирлөөсүндө, пируват карбоксилденүүсү өстүрүлгөн мээче гранула нейрондорунда оксалоацетаттын синтезин сактайт деп эсептелет (34). Бирок, бул механизмдердин мээ тканы үчүн физиологиялык мааниси (атеросклероз негизинен астроциттер менен чектелет деп эсептелет) дагы эле маанилүү физиологиялык мааниге ээ (43). Бул учурда, биздин маалыматтар көрсөткөндөй, организмде OXPHOS тарабынан бузулган PNлер TCA пулунун ортоңку продуктуларын толуктоонун эки негизги булагы болгон BCAA деградациясына жана пируват карбоксилденүүсүнө өтүшү мүмкүн. BCAA катаболизминин нейрондук энергия алмашуусуна кошкон салымы болжолдонгону менен, глутаматтын жана GABAнын нейротрансмиссиядагы ролунан тышкары (44), бул механизмдер үчүн in vivo далилдер дагы эле жок. Ошондуктан, дисфункционалдык PNлер атеросклерозду күчөтүү менен ассимиляция процесси менен шартталган TCA ортоңку продуктуларын керектөөнү автоматтык түрдө компенсациялай алат деп божомолдоо оңой. Атап айтканда, митохондриялык дисфункциясы бар көбөйүп жаткан клеткаларда аспарагин кислотасына болгон суроо-талаптын жогорулашын сактоо үчүн PCxтин жогорулашы талап кылынышы мүмкүн (45). Бирок, биздин метаболомикалык анализибиз Mfn2cKO PNдериндеги аспарагин кислотасынын туруктуу абалындагы деңгээлде эч кандай олуттуу өзгөрүүлөрдү аныктаган жок (S6A-сүрөт), бул, кыязы, көбөйүп жаткан клеткалар менен митоздон кийинки нейрондордун ортосундагы аспарагин кислотасынын ар кандай метаболикалык колдонулушун чагылдырат. In vivo дисфункционалдык нейрондордо PCxтин жогорулашынын так механизми мүнөздөлө элек болсо да, биз бул эрте жооп нейрондордун кычкылдануу-калыбына келүү абалын сактоодо маанилүү ролду ойной турганын көрсөттүк, бул мээче кесимдериндеги FLIM эксперименттеринде көрсөтүлгөн. Атап айтканда, PNлердин PCxти жогорулатышына жол бербөө кычкылдануу абалына алып келип, клеткалардын өлүмүн тездетиши мүмкүн. BCAA деградациясынын активдешүүсү жана пируваттын карбоксилдениши митохондриялык дисфункциянын перифериялык ткандарын мүнөздөө жолдору эмес (7). Ошондуктан, алар OXPHOS жетишсиз нейрондордун артыкчылыктуу өзгөчөлүгү болуп көрүнөт, бирок жалгыз өзгөчөлүк болбосо да, нейродегенерация үчүн маанилүү.
Мээче оорусу – бул атаксия катары көрүнгөн жана көп учурда PNге зыян келтирген гетерогендик нейродегенеративдик оорунун бир түрү (46). Бул нейрон популяциясы митохондриялык дисфункцияга өзгөчө алсыз, анткени чычкандардагы алардын селективдүү дегенерациясы адамдын омуртка-мээче атаксиясын мүнөздөгөн көптөгөн кыймыл симптомдорун кайра чыгарууга жетиштүү (16, 47, 48). Маалыматтарга ылайык, мутант гени бар трансгендик чычкан модели адамдын омуртка-мээче атаксиясына байланыштуу жана митохондриялык дисфункцияга ээ (49, 50), бул PNPHдеги OXPHOS жетишсиздигинин кесепеттерин изилдөөнүн маанилүүлүгүн баса белгилейт. Ошондуктан, бул уникалдуу нейрон популяциясын натыйжалуу бөлүп алуу жана изилдөө өзгөчө ылайыктуу. Бирок, PNлер басымга абдан сезгич жана бүтүндөй мээче клеткаларынын популяциясынын аз бөлүгүн түзөрүн эске алганда, көптөгөн омикага негизделген изилдөөлөр үчүн аларды бүтүндөй клеткалар катары селективдүү бөлүү дагы эле кыйын аспект болуп саналат. Башка клетка түрлөрүнүн (айрыкча чоңдордун ткандарынын) булганышынын абсолюттук жоктугуна жетүү дээрлик мүмкүн эмес болсо да, биз протеомиканын төмөнкү агымын анализдөө үчүн жетиштүү сандагы жашоого жөндөмдүү нейрондорду алуу үчүн FACS менен натыйжалуу диссоциациялоо кадамын айкалыштырдык жана бүтүндөй мээче жөнүндө маалыматтар топтомуна салыштырмалуу белоктун жогорку камтуусуна (болжол менен 3000 белок) ээ болдук (51). Бүтүндөй клеткалардын жашоого жөндөмдүүлүгүн сактоо менен, биз бул жерде сунуштаган ыкма митохондриядагы зат алмашуу жолдорунун өзгөрүүлөрүн текшерүүгө гана эмес, ошондой эле анын цитоплазмалык аналогдорундагы өзгөрүүлөрдү текшерүүгө мүмкүндүк берет, бул клетка түрүн байытуу үчүн митохондриялык мембрана тегдерин колдонууну толуктайт. Татаал ткандардагы митохондриялардын санынын жаңы ыкмасы (52, 53). Биз сүрөттөгөн ыкма Пуркинье клеткаларын изилдөө менен гана байланыштуу эмес, ошондой эле митохондриялык дисфункциянын башка моделдерин кошо алганда, оорулуу мээлердеги зат алмашуу өзгөрүүлөрүн чечүү үчүн каалаган клетка түрүнө оңой колдонулушу мүмкүн.
Акырында, биз бул зат алмашуунун кайра түзүлүшү процессинде клеткалык стресстин негизги белгилерин толугу менен жокко чыгара турган жана нейрондордун дегенерациясынын алдын ала турган терапиялык терезени аныктадык. Ошондуктан, бул жерде сүрөттөлгөн кайра зымдоонун функционалдык кесепеттерин түшүнүү митохондриялык дисфункция учурунда нейрондордун жашоого жөндөмдүүлүгүн сактоонун мүмкүн болгон дарылоо ыкмалары жөнүндө фундаменталдык түшүнүктөрдү бере алат. Бул принциптин башка неврологиялык ооруларга колдонулушун толук ачып берүү үчүн мээнин башка клеткаларынын түрлөрүндөгү энергия алмашуусундагы өзгөрүүлөрдү изилдөөгө багытталган келечектеги изилдөөлөр зарыл.
MitoPark чычкандары мурда сүрөттөлгөн (31). loxP капталындагы Mfn2 гендери бар C57BL/6N чычкандары мурда сүрөттөлгөн (18) жана L7-Cre чычкандары менен аргындаштырылган (23). Натыйжада кош гетерозиготалуу тукум андан кийин гомозиготалуу Mfn2loxP/Mfn2loxP чычкандары менен аргындаштырылган, бул Mfn2 үчүн Пуркиньеге мүнөздүү ген нокауттарын (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) пайда кылат. Жупташуунун бир бөлүгүндө Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллели (stop-mtYFP) кошумча аргындаштыруу аркылуу киргизилген (20). Бардык жаныбарлар менен жүргүзүлгөн процедуралар европалык, улуттук жана институционалдык көрсөтмөлөргө ылайык жүргүзүлүп, Түндүк Рейн-Вестфалия, Германиянын Умвельт жана Вербраухершутц шаарларындагы LandesamtfürNatur тарабынан бекитилген. Жаныбарлар менен иштөө ошондой эле Европалык лабораториялык жаныбарлар илимдери ассоциацияларынын федерациясынын көрсөтмөлөрүнө ылайык жүргүзүлөт.
Кош бойлуу аялдын жатын моюнчасынын чыгып кетишине наркоз берилгенден кийин, чычкандын эмбриону бөлүнүп алынат (E13). Кортекс 10 мМ Хепес кошулган Хэнкстин тең салмактуу туз эритмесинде (HBSS) бөлүнүп, папаин (20 U/мл) жана цистеин (1 мкг/мл) камтыган Дульбекконун модификацияланган бүркүт чөйрөсүнө өткөрүлдү. Ткандарды DMEMде инкубациялап, ферменттик сиңирүү жолу менен диссоциациялашты. Ml) 37°C температурада 20 мүнөт, андан кийин 10% түйүлдүк уйдун сывороткасы кошулган DMEMде механикалык түрдө майдаланды. Клеткалар сүрөткө тартуу анализи үчүн 6 см культуралык идишке 2×106 тыгыздыкта же 0,5×105 клетка/см2 тыгыздыкта полилизин менен капталган айнек каптамаларга себилген. 4 сааттан кийин чөйрө 1% B27 кошулмасын жана 0,5 мМ GlutaMax камтыган Нейробазалдык сывороткасыз чөйрө менен алмаштырылды. Андан кийин нейрондор эксперименттин жүрүшүндө 37°C жана 5% CO2 температурада кармалып, жумасына бир жолу азыктандырылган. In vitro шартында рекомбинацияны индукциялоо үчүн, in vitro шартында экинчи күнү нейрондорду дарылоо үчүн төмөнкү AAV9 вирусунун векторунун 3 мкл (24 кудуктуу өстүрүүчү идиш) же 0,5 мкл (24 кудуктуу пластина) колдонулган: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, каталог номери 105530-AAV9) жана AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталог номери 105545-AAV9).
Чычкандын Mfn1 жана Mfn2 комплементардуу ДНКсы (тиешелүүлүгүнө жараша Addgene плазмидасы #23212 жана #23213 алынган) С-терминалында V5 ырааттуулугу (GKPIPNPLLGLDST) менен белгиленип, T2A ырааттуулугу аркылуу кадрдагы mCherry менен биригип кетет. Grx1-roGFP2 - Гейдельберг Т.П. Дик DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum) белеги. tdTomato кассетасын кадимки клондоо ыкмаларын колдонуу менен алмаштыруу менен, кассета pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 жана pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 векторлорун түзүү үчүн pAAV-CAG-FLEX-tdTomato магынасына (Addgene шилтеме номери 28306) субклондолгон. Ушул сыяктуу стратегия pAAV-CAG-FLEX-mCherry башкаруу векторун түзүү үчүн колдонулган. AAV-shPCx конструкциясын түзүү үчүн плазмидалык AAV вектору (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) талап кылынат, ал чычкан PCxти бутага алган shRNAны коддогон ДНК ырааттуулугун камтыйт (5′CTTTCGCTTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAG 3′). U6 промоторунун көзөмөлүндө mCherry CMV промоторунун көзөмөлүндө колдонулат. Кошумча AAV векторлорун өндүрүү өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык жүргүзүлдү (Cell Biolabs). Кыскасы, кальций фосфаты ыкмасын колдонуу менен mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ташуучу трансфердик плазмиданы 293AAV клеткаларынын-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) же Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) коддоочу генди, ошондой эле AAV1 капсиддик белогун жана кошумча белокту коддоочу плазмиданын таңгактоочу плазмидасы. Чийки вирустун үстүнкү катмары кургак муз/этанол ваннасында тоңдуруу-эритүү циклдери жана фосфат буфердик туздуу эритмеде (PBS) лизистелген клеткалар аркылуу алынган. AAV вектору үзгүлтүксүз йодиксанол градиентинин ультрацентрифугалоосу менен тазаланган (32 000 айн/мин жана 4°C температурада 24 саат) жана Amicon ультра-15 борбордон четтөөчү чыпкасын колдонуу менен концентрацияланган. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 геномдун көчүрмөсү (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX геномунун титрлери мурда сүрөттөлгөндөй (54), реалдуу убакыттагы сандык ПТР (qPCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/мл) жана AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/мл) менен өлчөнгөн.
Баштапкы нейрондор муздак 1x PBSте кырылып алынып, гранулаланып, андан кийин фосфатаза жана протеаза ингибитору (Roche) камтылган 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолат/PBS лизис буферинде гомогендештирилген. Белоктордун сандык аныктоосу бицинхонин кислотасынын анализин (Thermo Fisher Scientific) колдонуу менен жүргүзүлдү. Андан кийин белоктор SDS-полиакриламид гелинин электрофорези менен бөлүнүп, андан кийин поливинилиден фторид мембранасына блоттолгон (GE Healthcare). Спецификалык эмес жерлерди бөгөп, TBSTде (Tween менен Tris-буферленген туздуу эритмеде) 5% сүттө баштапкы антитело менен (кененирээк маалымат алуу үчүн S1 таблицасын караңыз), жуу кадамдары жана TBST Incubateде экинчилик антитело менен инкубациялаңыз. Баштапкы антитело менен +4°C температурада түнү бою инкубациялаңыз. Жуудан кийин, экинчилик антителону бөлмө температурасында 2 саат бою колдонуңуз. Андан кийин, ошол эле блотту анти-β-актин антителосу менен инкубациялоо менен, ошол эле жүктөм тастыкталды. Хемилюминесценцияга өтүү жана хемилюминесценцияны күчөтүү аркылуу аныктоо (GE Healthcare).
Айнек капкактарга мурда себилген нейрондор көрсөтүлгөн убакыт аралыгында бөлмө температурасында 10 мүнөт 4% параформальдегид (PFA)/PBS менен фиксацияланган. Капкактарга алгач бөлмө температурасында 5 мүнөт 0,1% Triton X-100/PBS, андан кийин бөгөттөөчү буферде [3% уйдун кан сары суусунун альбумини (BSA)/PBS] сиңирилген. Экинчи күнү капкактар ​​блоктоочу буфер менен жуулуп, тиешелүү флуорофор менен конъюгацияланган экинчилик антитело менен бөлмө температурасында 2 саат инкубацияланган; акырында, үлгүлөр PBSте 4′,6-диамидино-2-Фенилиндол (DAPI) менен боёлуп, андан кийин микроскоптук слайдга Aqua-Poly/Mount менен фиксацияланган.
Чычкандар (эркек жана ургаачы) кетамин (130 мг/кг) жана ксилазин (10 мг/кг) ич көңдөйүнө сайылып, карпрофен анальгетик (5 мг/кг) менен тери астына сайылып, жылуу төшөк менен жабдылган стереотактикалык аспапка (Kopf) жайгаштырылган. Баш сөөгүн ачып, тиш бургусу менен мээче кабыгынын сөөккө туура келген бөлүгүн суюлтуңуз (лямбдадан: куйрук 1.8, каптал 1, IV жана V бөлүкчөлөрүнө туура келет). Төмөндөгү кан тамыр системасын бузбоо үчүн баш сөөгүндө кичинекей тешик жасоо үчүн ийри шприц ийнесин колдонуңуз. Андан кийин ичке тартылган айнек капилляр микро-тешикке жай киргизилет (катуу кабыктын вентралдык тарабында -1.3төн -1ге чейин) жана 200дөн 300 нлге чейинки AAV кол менен шприцтер (Наришиге) менен микро-инжекторго (Наришиге) 10дон 20 мүнөткө чейинки аралыкта бир нече жолу төмөн басымда сайылат. Инфузиядан кийин, вирус толугу менен жайылышы үчүн капиллярды дагы 10 мүнөткө коюңуз. Капиллярлар алынып салынгандан кийин, жарааттын сезгенүүсүн азайтуу жана жаныбардын айыгып кетиши үчүн тери кылдаттык менен тигилет. Операциядан кийин бир нече күн бою жаныбарларга ооруну басаңдатуучу каражаттар (каспофен) берилип, алардын физикалык абалы кылдаттык менен көзөмөлдөнүп, андан кийин көрсөтүлгөн убакытта эвтаназия жасалган. Бардык процедуралар европалык, улуттук жана институттук көрсөтмөлөргө ылайык жүргүзүлүп, Германиянын Түндүк Рейн-Вестфалия штатындагы Умвельт жана Вербраухершутц шаарынын LandesamtfürNatur компаниясы тарабынан бекитилген.
Жаныбарлар кетамин (100 мг/кг) жана ксилазин (10 мг/кг) менен наркоздон өткөрүлүп, жүрөк алгач 0,1 М PBS, андан кийин PBSтеги 4% PFA менен перфузияланган. Ткань 4% PFA/PBSте 4°C температурада түнү бою бөлүнүп алынып, фиксацияланган. PBSтеги фиксацияланган мээден сагитталдык кесимдерди (калыңдыгы 50 мкм) даярдоо үчүн вибрациялык бычак (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрия) колдонулган. Башкача көрсөтүлбөсө, эркин калкып жүргөн кесимдерди боёо жогоруда сүрөттөлгөндөй (13) бөлмө температурасында жана аралаштырууда жүргүзүлгөн. Кыскасы, алгач алынган кесимдер бөлмө температурасында 15 мүнөт бою 0,5% Triton X-100/PBS менен өткөргүчтүккө учуратылган; кээ бир эпитоптор үчүн (Pcx жана Shmt2) 80°C температурада (Ph 9) трис-ЭДТА буферинде кесимдерди бул кадамдын ордуна 25 мүнөт ысытуу керек. Андан кийин, кесимдер баштапкы антитело менен (S1 таблицасын караңыз) 4°C температурада түнү бою аралаштырып инкубацияланган. Эртеси күнү кесимдер бөгөттөөчү буфер менен жуулуп, тиешелүү флуорофор менен конъюгацияланган экинчилик антитело менен бөлмө температурасында 2 саат бою инкубацияланган; акырында, кесимдер PBSте жакшылап жуулуп, DAPI менен боёлуп, андан кийин микроскоптук слайдга AquaPolymount менен бекитилген.
Үлгүнү сүрөткө тартуу үчүн ак жарык лазери жана 405 диоддук ультрафиолет лазери менен жабдылган лазердик сканерлөөчү конфокалдык микроскоп (TCS SP8-X же TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) колдонулган. Флуорофорду дүүлүктүрүү жана сигналды гибриддик детектор (HyDs) менен чогултуу аркылуу LAS-X программасы ырааттуу режимде Найквист үлгүсүнө ылайык келген үйүлгөн сүрөттөрдү чогултуу үчүн колдонулган: сандык эмес панелдер үчүн бул өтө динамикалык сигналдар (мисалы, соматикалык клеткаларда жана дендриттерде) mtYFP) BrightR режиминде PN санын аныктоо үчүн HyD колдонуңуз). Фонду азайтуу үчүн 0,3төн 6 нске чейинки дарбазалоо колдонулат.
Сорттолгон клеткаларды реалдуу убакыт режиминде сүрөткө тартуу. 1% B27 кошулмасын жана 0,5 мМ GlutaMax камтыган Neurobasal-A чөйрөсүндө сорттогондон кийин, клеткалар дароо поли-l-лизин менен капталган айнек слайддарга (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталог номери 80826) себилген, андан кийин клеткалар чөгүшү үчүн аны 37°C температурада жана 5% CO2де 1 саат кармашкан. Реалдуу убакыт режиминде сүрөткө тартуу ак лазер, HyD, 63×[1,4 сандык диафрагма (NA)] май объективдүү линзасы жана жылытуу баскычы менен жабдылган Leica SP8 лазердик сканерлөөчү конфокалдык микроскопто жүргүзүлгөн.
Чычканга тез арада көмүр кычкыл газы менен наркоз берилип, баштары кесилген, мээ баш сөөгүнөн тез алынып, 200 мкм калыңдыктагы (13C маркировкалоо эксперименти үчүн) же 275 мкм калыңдыктагы (эки фотон эксперименти үчүн) сагитталдык кесимге кесилген, ал төмөнкү материалдар менен толтурулган. Балмуздак (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Валлдорф, Германия) төмөнкү заттар менен толтурулган: 125 мМ муздак, көмүртек менен каныккан (95% O2 жана 5% CO2) аз Ca2 + жасалма жүлүн суюктугу (ACSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфери, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкоза, 0,5 мМ CaCl2 жана 3,5 мМ MgCl2 (осмостук басым 310дон 330 ммольго чейин). Алынган мээ кесимдерин жогорку Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфат буфери, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 жана 2.0 мМ MgCl2) Орточо (рН 7.4 жана 310дон 320 ммольго чейин) камтыган инкубация алдындагы камерага которуңуз.
Сүрөткө тартуу процессинде кесимдер атайын сүрөткө тартуу бөлмөсүнө жылдырылып, эксперимент 32°тан 33°Cге чейинки туруктуу температурада үзгүлтүксүз ACSF перфузиясы астында жүргүзүлдү. Кесимдерди сүрөткө тартуу үчүн Leica 25x объективдүү линзасы (NA 0.95, суу) менен жабдылган көп фотондуу лазердик сканерлөөчү микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), Ti: Sapphire лазери (Chameleon Vision II, Coherent) колдонулган. FLIM модулу (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2нин FLIMи. PNдердин цитоплазмалык кычкылдануу-калыбына келүү абалындагы өзгөрүүлөр сагитталдык мээ кесимдеринде эки фотондуу FLIM менен өлчөнгөн, мында Grx1-roGFP2 биосенсору PNдерди бутага алган. PN катмарында, жашоого жөндөмдүү PN (башкача айтканда, мончок сымал түзүлүштүн же дендриттер боюнча нейрондук морфологиялык өзгөрүүлөрдүн жоктугу) жана кош оң roGFP2 сенсору жана shRNA PCx же анын башкаруу ырааттуулугун коддогон AAV (ар бири mCherryди биргелешип экспрессиялайт) бар экенине ынануу үчүн кесимдин бетинен болжол менен 50-80 мкм төмөн алуу талаасы тандалат. 2x санариптик масштабдоо менен бир стектүү сүрөттөрдү чогултуңуз [дүүлүктүрүүчү толкун узундугу: 890 нм; 512 нм 512 пиксел]. Аныктоо: ички HyD, флуоресцеин изотиоцианаты (FITC) чыпка тобу] жана ийри сызыкты тууралоо үчүн жетиштүү фотондор чогултулганын (жалпысынан 1000 фотон) камсыз кылуу үчүн 2-3 мүнөттүн ичинде орточо сүрөт колдонулат. Grx1-roGFP2 зондун сезгичтиги жана FLIM шарттарын текшерүү перфузиялык ACSFке экзогендик 10 мМ H2O2 кошууда roGFP2нин жашоо узактыгынын маанисин көзөмөлдөө (кычкылданууну максималдуу түрдө жогорулатуу үчүн, натыйжада жашоо узактыгы жогорулайт) жана андан кийин 2 мМ дитиотреитол кошуу (азайуу даражасын минималдаштырат, натыйжада жашоо узактыгы төмөндөйт) аркылуу жүргүзүлдү (S8-сүрөт, Dден Gге чейин). Алынган натыйжаларды талдоо үчүн FLIMfit 5.1.1 программасын колдонуңуз, бүтүндөй сүрөттүн бирдиктүү экспоненциалдык ажыроо ийри сызыгын өлчөнгөн IRFке (прибордун жооп берүү функциясы) тууралаңыз, ошондо χ2 болжол менен 1ге барабар. Бир PNдин жашоо узактыгын эсептөө үчүн нерв денесинин айланасындагы маска кол менен тартылып, ар бир маскадагы орточо жашоо узактыгы сандык аныктоо үчүн колдонулган.
Митохондриялык потенциалды талдоо. Курч кесилиш перфузияланган ACSFке түздөн-түз кошулган 100 нМ TMRM менен 30 мүнөт инкубациялангандан кийин, PNлердин митохондриялык потенциалынын өзгөрүүлөрү эки фотондук микроскоп менен өлчөнгөн. TMRM сүрөткө тартуу зондду 920 нмде козгоо жана сигналдарды чогултуу үчүн ички HyD (тетраметилродамин изотиоцианаты: 585/40 нм) колдонуу менен жүргүзүлдү; ошол эле козгоо толкун узундугун колдонуу менен, бирок mtYFP сүрөтүн тартуу үчүн башка ички HyD (FITC:525/50) колдонуу менен. Бир клетка деңгээлиндеги митохондриялык потенциалды баалоо үчүн ImageJ'нин Image Calculator плагинин колдонуңуз. Кыскасы, тиешелүү каналдын бир кабаттуу конфокалдык сүрөтүндө Пуркинье сомалидеги TMRM сигналын көрсөткөн митохондриялык аймакты аныктоо үчүн плагин теңдемеси колдонулат: сигнал = мин (mtYFP, TMRM). Андан кийин пайда болгон маскадагы пикселдик аянт сандык жактан аныкталат, андан кийин митохондриялык потенциалды көрсөткөн митохондриялык фракцияны алуу үчүн mtYFP каналынын тиешелүү босоголук бир кабаттуу сүрөтүндө нормалдаштырылат.
Сүрөт Huygens Pro (Scientific Көлөмдүү Сүрөткө тартуу) программасы менен майдаланган. Плиткалардын сканерленген сүрөттөрү үчүн бир плитканын монтажы LAS-X программасы тарабынан берилген автоматтык тигүү алгоритмин колдонуу менен жасалат. Сүрөттү калибрлегенден кийин, сүрөттү андан ары иштетүү жана жарыктыгын жана контрастын бирдей тууралоо үчүн ImageJ жана Adobe Photoshop колдонуңуз. Графикалык даярдоо үчүн Adobe Illustrator колдонуңуз.
мтДНКнын фокустук анализи. мтДНКнын жабыркоолорунун саны конфокалдык микроскоп аркылуу ДНКга каршы антителолор менен белгиленген мээче кесилиштеринде сандык жактан аныкталган. Ар бир максаттуу аймак клетканын денеси жана ар бир клетканын ядросу үчүн түзүлгөн жана тиешелүү аймак Multi Measure плагини (ImageJ программасы) аркылуу эсептелген. Цитоплазмалык аймакты алуу үчүн клетканын денесинин аймагынан ядролук аймакты кемитүү керек. Акырында, босогодогу сүрөттө мтДНКны көрсөткөн цитоплазмалык ДНК чекиттерин автоматтык түрдө сандык жактан аныктоо үчүн Analyze Particles плагини (ImageJ программасы) колдонулган жана алынган жыйынтыктар CTRL чычкандарынын PN орточо маанисине нормалдаштырылган. Жыйынтыктар клеткадагы нуклеозиддердин орточо саны катары көрсөтүлөт.
Белок экспрессиясын талдоо. ImageJ'нин Image Calculator плагинин колдонуп, PNдеги белок экспрессиясын бир клетка деңгээлинде баалаңыз. Кыскасы, тиешелүү каналдын бир катмарлуу конфокалдык сүрөтүндө, сигнал = мин (mtYFP, антитело) теңдемеси аркылуу Пуркинадагы белгилүү бир антителого иммунореактивдүүлүктү көрсөткөн митохондриялык аймак аныкталат. Андан кийин пайда болгон маскадагы пикселдик аянт сандык жактан аныкталат, андан кийин көрсөтүлгөн белоктун митохондриялык фракциясын алуу үчүн mtYFP каналынын тиешелүү босоголук бир кабаттуу сүрөтүндө нормалдашат.
Пуркинье клеткаларынын тыгыздыгын талдоо. ImageJ программасынын клетка эсептегичи плагини саналган Пуркинье клеткаларынын санын саналган клеткалар ээлеген мээче шакекчесинин узундугуна бөлүү жолу менен Пуркинье тыгыздыгын баалоо үчүн колдонулган.
Үлгү даярдоо жана чогултуу. Контролдук топтун жана Mfn2cKO чычкандарынын мээлери 0,1 М фосфат буфериндеги (ПФ) 2% ПФА/2,5% глутаральдегидге фиксацияланган, андан кийин короналдык кесилиштер инфузорияларды (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) колдонуу менен даярдалган (калыңдыгы 50дөн 60 мкмге чейин). Андан кийин ПФ буферине бөлмө температурасында 1% os тетраоксидинде жана 1,5% калий ферроцианидинде 1 саатка бекитилген. Кесилиштер дистилденген суу менен үч жолу жуулуп, андан кийин 20 мүнөт бою 1% уранил ацетаты бар 70% этанол менен боёлгон. Андан кийин кесилиштер сорттолгон спиртте кургатылган жана кремний менен капталган айнек слайддардын ортосуна Durcupan ACM (Araldite куюучу чайыр M) эпоксиддик чайырына (Электрондук микроскопия илимдери, каталог номери 14040) салынган, акырында 60°C температурада меште 48 саат полимерлештирилген. Мээче кабыгынын аймагы тандалып алынып, 50 нм өтө жука кесимдер Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) аппаратында кесилип, полистирол пленкасы менен капталган 2×1 мм жез кесим торчосунан алынган. Кесимдер 10 мүнөт бою 4% уранил ацетатынын суудагы эритмеси менен боёлуп, бир нече жолу суу менен, андан кийин 10 мүнөт бою Рейнольдс коргошун цитраты менен суудагы жуулган, андан кийин бир нече жолу суу менен жуулган. Микрографтар Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, АКШ) трансмиссиялык электрондук микроскобу менен TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 санарип камерасы (TVIPS GmbH, Гаутинг, АКШ) аркылуу тартылган.
AAV менен ооруган чычкандардын мээси бөлүнүп, 1 мм калыңдыктагы сагитталдык кесимге кесилген, ал эми мээче AAV менен ооруган шакекти (башкача айтканда, mCherry экспрессиясын) аныктоо үчүн флуоресценциялык микроскоп менен текшерилген. AAV саймасы кеминде эки удаалаш мээче шакекчесиндеги Пуркинье клетка катмарынын (б.а. дээрлик бүт катмардын) өтө жогорку трансдукциялык эффективдүүлүгүнө алып келген эксперименттер гана колдонулат. AAV менен трансдукцияланган цикл түнү бою фиксациядан кийин микродиссекцияланган (0,1 М какаот буферинде 4% PFA жана 2,5% глутаральдегид) жана андан ары иштетилген. EPONду киргизүү үчүн, фиксацияланган ткань 0,1 М натрий какаот буфери (Applichem) менен жуулуп, 0,1 М натрий какаот буферинде (Applichem) 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) менен 4 саат инкубацияланган, андан кийин 2 саат жуулган. 0,1 М кокамид буфери менен 3 жолу кайталаңыз. Андан кийин, этанолдун өйдө көтөрүлүүчү катарлары ар бир этанол эритмесин 4°C температурада 15 мүнөт инкубациялоо үчүн ткандарды суусуздандыруу үчүн колдонулган. Ткандар пропилен кычкылына которулуп, EPONдо (Sigma-Aldrich) 4°C температурада түнөп инкубацияланган. Ткандарды бөлмө температурасында жаңы EPONго 2 саатка коюп, андан кийин 62°C температурада 72 саатка жайгаштырыңыз. Ультрамикротомду (Leica Microsystems, UC6) жана алмаз бычагын (Diatome, Biel, Швейцария) колдонуп, 70 нм ультра жука кесимдерди кесип, 1,5% уранил ацетат менен 37°C температурада 15 мүнөт боёп, 4 мүнөт коргошун цитратынын эритмеси менен боёңуз. Электрондук микрографтар Camera OneView 4K 16-бит (Gatan) жана DigitalMicrograph программасы (Gatan) менен жабдылган JEM-2100 Plus трансмиссиялык электрондук микроскобу (JEOL) аркылуу тартылган. Анализ үчүн 5000× же 10000× санариптик зум менен электрондук микрографтар алынган.
Митохондриянын морфологиялык анализи. Бардык анализдер үчүн жеке митохондриянын контурлары ImageJ программасын колдонуу менен санарип сүрөттөрүндө кол менен белгиленген. Ар кандай морфологиялык параметрлер талданат. Митохондриянын тыгыздыгы ар бир клетканын жалпы митохондриялык аянтын цитоплазма аянтына (цитоплазманын аянты = клетканын аянты-клетка ядросунун аянты) × 100 бөлүү менен алынган пайыз катары көрсөтүлөт. Митохондриянын тегеректиги [4π∙(аянт/периметр 2)] формуласы менен эсептелет. Митохондриянын ista морфологиясы талданып, алардын негизги формаларына жараша эки категорияга ("түтүкчөлүү" жана "ыйрычка") бөлүнгөн.
Аутофагосома/лизосомалардын саны жана тыгыздыгын талдоо. ImageJ программасын колдонуп, санариптик сүрөттө ар бир аутофагосоманын/лизосоманын контурларын кол менен белгилеңиз. Аутофагосома/лизосома аянты ар бир клетканын жалпы аутофагосома/лизосома структурасынын аянтын цитоплазма аянтына бөлүү менен эсептелген пайыз катары көрсөтүлөт (цитоплазманын аянты=клетка аянты-ядро аянты)×100. Аутофагосомалардын/лизосомалардын тыгыздыгы жалпы санды клеткадагы аутофагосома/лизосома структураларынын санына бөлүү менен эсептелет (цитоплазма аянты боюнча) (цитоплазма аянты = клетка аянты-ядро аянты).
Курч кесүү жана үлгү даярдоо үчүн маркировкалоо. Глюкозаны маркировкалоону талап кылган эксперименттер үчүн, курч мээ кесимдерин каныккан көмүртек (95% O2 жана 5% CO2), жогорку Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфат буфери, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 жана 2.0 мМ MgCl2, рН 7.4кө жана 310дон 320 мОсмге чейин туураланган) камтыган инкубация алдындагы камерага өткөрүп бериңиз, анда глюкоза 13C6- Глюкозанын ордун басат (Eurisotop, каталог номери CLM-1396). Пируватты белгилөөнү талап кылган эксперименттер үчүн, курч мээ кесимдерин жогорку Ca2 + ACSFке (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфаты буфери, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 кошуп, 2.0 мМ MgCl2 кошуп, рН 7.4кө жана 310дон 320 мОсмге чейин тууралап, 1 мМ 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталог номери CLM-1082) кошуңуз. Кесимдерди 37°C температурада 90 мүнөт инкубациялаңыз. Эксперименттин аягында кесимдер 75 мМ аммоний карбонатын камтыган суу эритмеси (рН 7.4) менен тез жуулуп, андан кийин 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрилде (ACN): метанолдо: сууда гомогендештирилген. Кесилген жерлер музда 30 мүнөт инкубациялангандан кийин, үлгүлөр 21 000 г температурада 4°C температурада 10 мүнөт центрифугаланган жана тунук үстүнкү катмар SpeedVac концентраторунда кургатылган. Алынган кургатылган метаболит грануласы анализге чейин -80°C температурада сакталган.
13 С-белгиленген аминокислоталардын суюк хроматография-массалык спектрометрия анализи. Суюк хроматография-массалык спектрометрия (LC-MS) анализи үчүн метаболит грануласы 75 мкл LC-MS класстагы сууда (Honeywell) кайра эритилген. 21 000 г температурада 4°C температурада 5 мүнөт центрифугалагандан кийин, аминокислота агымын анализдөө үчүн 20 мкл такталган супернатант колдонулган, ал эми экстракттын калган бөлүгү дароо аниондук анализ үчүн колдонулган (төмөндө караңыз). Аминокислота анализи мурда сүрөттөлгөн бензоилхлориддик деривация протоколун колдонуу менен жүргүзүлдү (55, 56). Биринчи кадамда 20 мкл метаболит экстрактына 10 мкл 100 мМ натрий карбонаты (Sigma-Aldrich) кошулган, андан кийин LC класстагы ACNге 10 мкл 2% бензоилхлорид (Sigma-Aldrich) кошулган. Үлгү кыска убакытка аралаштырылып, андан кийин 21 000 g ылдамдыкта 20°C температурада 5 мүнөт центрифугаланган. Тазаланган үстүнкү катмарды конус сымал айнек салынмасы бар (200 мкл көлөмдөгү) 2 мл автосамплер флаконуна салыңыз. Үлгүлөр Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) жогорку чечилиштеги тактыктагы массалык спектрометрине (Thermo Fisher Scientific) туташтырылган Acquity iClass өтө жогорку өндүрүмдүүлүктөгү LC системасы (Waters) аркылуу талданган. Талдоо үчүн, алынган үлгүнүн 2 мкл өлчөмү 1,8 мкм бөлүкчөлөрдү камтыган 100 × 1,0 мм жогорку күчтүү кремний диоксиди T3 колонкасына (Waters) куюлган. Агым ылдамдыгы 100 мкл/мин, ал эми буфердик система А буферинен (10 мМ аммоний форматы жана суудагы 0,15% кумурска кислотасы) жана В буферинен (ACN) турат. Градиент төмөнкүдөй: 0 мүнөттө 0%B; 0%B. 0дон 0,1 мүнөткө чейин 0дон 15%га чейин B; 15тен 17%га чейин B 0,1ден 0,5 мүнөткө чейин; B 17ден 55%га чейин 0,5тен 14 мүнөткө чейин; B 55тен 70%га чейин 14төн 14,5 мүнөткө чейин; 14,5тен 70ке чейин 100%га чейин B 18 мүнөттө; 100%га чейин B 18ден 19 мүнөткө чейин; 100дөн 0%га чейин B 19дан 19,1 мүнөткө чейин; 0%га чейин B 19,1ден 28 мүнөткө чейин (55, 56). QE-HF массалык спектрометри оң иондоштуруу режиминде m/z (масса/заряд катышы) массалык диапазону 50дөн 750гө чейин иштейт. Колдонулган чечилиш 60 000, ал эми алынган күчөтүүнү башкаруу (AGC) ионунун максаты 3 × 106, ал эми максималдуу ион убактысы 100 миллисекунд. Ысытылган электрочачыраткыч иондоштуруу (ESI) булагы 3,5 кВ чачыратуу чыңалуусунда, капиллярдык температура 250°C, кабыкчанын аба агымы 60 AU (каалаган бирдиктер) жана 20 AU. 250°C көмөкчү аба агымында иштейт. S линзасы 60 AU деп коюлган.
13C белгиленген органикалык кислоталардын анион хроматографиясы-MS анализи. Калган метаболит чөкмөсү (55 мкл) QE-HF массалык спектрометрине (Thermo Fisher Scientific) туташтырылган Dionex ион хроматография системасы (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) аркылуу талданды. Кыскасы, 5 мкл метаболит экстракты HPLC (2 мм×250 мм, бөлүкчөлөрдүн өлчөмү 4 мкм, Thermo Fisher Scientific) менен жабдылган Dionex IonPac AS11-HC колонкасына толтуруу катышы 1 болгон жарым-жартылай цикл режиминде сайылды.) Dionex IonPac AG11-HC коргоо колонкасы (2 мм x 50 мм, 4 мкм, Thermo Fisher Scientific). Колонканын температурасы 30°C температурада кармалат, ал эми автоүлгү 6°C температурага коюлат. Элюент генератору аркылуу калий гидроксиди градиентин түзүү үчүн деиондоштурулган суу менен камсыздалган калий гидроксиди картриджин колдонуңуз. Метаболиттерди бөлүү 380 мкл/мин агым ылдамдыгында, төмөнкү градиентти колдонуу менен жүргүзүлдү: 0дон 3 мүнөткө чейин, 10 мМ KOH; 3төн 12 мүнөткө чейин, 10дон 50 мМ KOH; 12ден 19 мүнөткө чейин, 50дөн 100 мМ KOH; 19дан 21 мүнөткө чейин, 100 мМ KOH; 21ден 21,5 мүнөткө чейин, 100дөн 10 мМ KOH. Колонна 10 мМ KOH астында 8,5 мүнөт бою кайра тең салмакталган.
Элюцияланган метаболиттер колонкадан кийин 150 мкл/мин изопропанол кошумча агымы менен бириктирилип, андан кийин терс иондоштуруу режиминде иштеген жогорку чечилиштеги массалык спектрометрге багытталат. MS масса диапазонун m/z 50дөн 750гө чейинки 60 000 чечилиш менен көзөмөлдөп турат. AGC 1×106га коюлган, ал эми максималдуу ион убактысы 100 мс сакталат. Ысытылган ESI булагы 3,5 кВ чачыратуу чыңалуусунда иштеген. Ион булагынын башка жөндөөлөрү төмөнкүдөй: капиллярдык температура 275°C; кабык газынын агымы, 60 AU; көмөкчү газ агымы, 300°Cде 20 AU жана S линзасын 60 AUга коюу.
13C белгиленген метаболиттердин маалыматтарын талдоо. Изотоптордун катышынын маалыматтарын талдоо үчүн TraceFinder программасын (4.2 версиясы, Thermo Fisher Scientific) колдонуңуз. Ар бир кошулманын окшоштугу ишенимдүү шилтеме кошулмасы менен текшерилип, көз карандысыз талданган. Изотопторду байытуу анализин жүргүзүү үчүн, ар бир 13C изотопунун (Mn) алынган ион хроматограммасынын (XIC) аянты [M + H]+ дан алынган, мында n - аминокислоталарды талдоо үчүн колдонулган максаттуу кошулманын көмүртек саны же [MH]+ аниондорду талдоо үчүн колдонулат. XICтин массалык тактыгы миллионго беш бөлүктөн аз, ал эми RT тактыгы 0,05 мүнөт. Байытуу анализи ар бир аныкталган изотоптун тиешелүү кошулманын бардык изотопторунун суммасына катышын эсептөө менен жүргүзүлөт. Бул катыштар ар бир изотоп үчүн пайыздык маанилер катары берилет жана натыйжалар мурда сүрөттөлгөндөй (42) молярдык пайыздык байытуу (MPE) катары көрсөтүлөт.
Тоңдурулган нейрон грануласы муздак 80% метанолдо (к/к) гомогендештирилип, аралаштырылып, -20°C температурада 30 мүнөт инкубацияланган. Үлгүнү кайрадан аралаштырып, +4°C температурада 30 мүнөт аралаштырыңыз. Үлгү 21 000 г температурада 4°C температурада 5 мүнөт центрифугаланган, андан кийин пайда болгон үстүнкү катмар чогултулуп, андан кийинки анализ үчүн SpeedVac концентраторун колдонуп 25°C температурада кургатылган. Жогоруда айтылгандай, сорттолгон клеткалардын аминокислоталарына LC-MS анализи жүргүзүлдү. TraceFinder (4.2 версиясы, Thermo Fisher Scientific) колдонуп, ар бир кошулманын моноизотоптук массасын колдонуу менен маалыматтарды талдоо жүргүзүлдү. Метаболит маалыматтарын кванттык нормалдаштыруу preprocessCore программалык пакетин (57) колдонуу менен жүргүзүлдү.
Кесимди даярдоо. Чычканга көмүр кычкыл газы тез арада анестезияланып, башы кесилген, мээси баш сөөгүнөн тез алынып салынган жана муз толтурулган титирөөчү бычак (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Германия) менен 300дөн 375 мкмге чейинки сагитталдык кесимдерге кесилген. Муздак көмүртек газификациясы (95% O2 жана 5% CO2) Төмөн Ca2 + ACSF (125.0 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 1.25 мМ натрий фосфат буфери, 25.0 мМ NaHCO3, 25.0 мМ d-глюкоза, 1.0 мМ CaCl2 жана 6.0 мМ MgCl2 рН 7.4кө жана 310дон 330 мОсмге чейин тууралоо). Алынган мээ кесимдерин рН 7,4 жана 310дон 320 мОсмге чейин Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфаты буфери, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 4,0 мМ CaCl2 жана mM 3,5 MgCl2) жогору болгон камерага салыңыз. Кесимдерди жаздыруудан мурун калыбына келтирүү үчүн 20-30 мүнөт сактаңыз.
жаздыруу. Бардык жаздыруулар үчүн бекитилген жаздыруу камерасы жана 20x сууга чөмүлүү объективдүү линзасы (Scientifica) менен жабдылган микроскоп баскычы колдонулган. Болжолдуу Пуркинье клеткалары (i) дененин өлчөмү, (ii) мээче анатомиялык жайгашуусу жана (iii) флуоресценттик mtYFP репортер генинин экспрессиясы боюнча аныкталган. Учунун каршылыгы 5тен 11 мегомго чейинки патч пипетка боросиликат айнек капилляры (GB150-10, 0,86 мм×1,5 мм×100 мм, Science Products, Хофхайм, Германия) жана горизонталдык пипетка Instruments (P-1000, Sutter), Novato, CA аркылуу тартылып алынган. Бардык жаздыруулар Signal программалык камсыздоосу (6.0 версиясы, Cambridge Electronic, Cambridge, Улуу Британия) тарабынан башкарылуучу ELC-03XS npi патч кыскыч күчөткүчү (npi electronic GmbH, Tam, Германия) аркылуу жүргүзүлгөн. Эксперимент 12,5 кГц үлгү алуу жыштыгында жазылган. Сигнал тиешелүүлүгүнө жараша 1,3 жана 10 кГц кесүү жыштыктары бар эки кыска өткөргүчтүү Бессель чыпкасы менен чыпкаланат. Мембрананын жана пипетканын сыйымдуулугу күчөткүчтү колдонуу менен компенсациялык схема менен компенсацияланат. Бардык эксперименттер Hokawo программалык камсыздоосу (2.8 версиясы, Хамаматсу, Герден, Германия) тарабынан башкарылган Orca-Flash 4.0 камерасынын (Хамаматсу, Герден, Германия) башкаруусу астында жүргүзүлдү.
Кадимки бүт клетканын конфигурациясы жана анализи. Жаздыруудан мурун, пипетканы төмөнкү заттарды камтыган ички эритме менен толтуруңуз: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ калий глюконаты, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ ATP (Mg), 0,5 мМ Гуанозин трифосфаты (GTP) (Na) жана 10,0 мМ креатинин фосфаты рН 7,25ке чейин туураланган, ал эми осмос басымы 290 мОсм (сахароза) болгон. Мембрананы жаруу үчүн 0 пА күч колдонулгандан кийин дароо эле, тынч турган мембрананын потенциалы өлчөнгөн. Киргизүү каршылыгы -40, -30, -20 жана -10 пА гиперполяризацияланган токту колдонуу менен өлчөнөт. Чыңалуу реакциясынын чоңдугун өлчөп, Ом мыйзамын колдонуп, кириш каршылыгын эсептеңиз. Өзүнөн-өзү пайда болгон активдүүлүк чыңалуу кыскычында 5 мүнөт бою жазылып алынган, ал эми sPSC жарым автоматтык таануу скриптин колдонуу менен Igor Pro (32 7.01 версиясы, WaveMetrics, Лейк Освего, Орегон, АКШ) программасында аныкталып, өлчөнгөн. IV ийри сызыгы жана туруктуу абалдагы ток батареяны ар кандай потенциалдарда (-110 мВдан баштап) кысуу жана чыңалууну 5 мВ кадамдар менен жогорулатуу аркылуу өлчөнөт. AP өндүрүшү деполяризациялоочу токту колдонуу менен текшерилген. Деполяризациялоочу ток импульсун колдонуу менен клетканы -70 мВга кысыңыз. Ар бир жазуу бирдигинин кадам өлчөмүн өзүнчө тууралаңыз (10дон 60 пАга чейин). Эң жогорку AP жыштыгын пайда кылган импульстук секириктерди кол менен эсептөө менен максималдуу AP жыштыгын эсептеңиз. AP босогосу бир же бир нече APди биринчи иштеткен деполяризациялоо импульсунун экинчи туундусун колдонуу менен талданат.
Перфорацияланган патчтын конфигурациясы жана анализи. Стандарттык протоколдорду колдонуп, перфорацияланган патчты жаздырыңыз. Төмөнкү ингредиенттерди камтыбаган АТФ жана ГТФсиз пипетканы колдонуңуз: 128 мМ глюконат К, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0.1 мМ EGTA жана 2 мМ MgCl2 жана рН 7.2ге чейин тууралаңыз (KOH колдонуп). Клетка мембранасынын көзөмөлсүз өткөрүмдүүлүгүн алдын алуу үчүн АТФ жана ГТФ клетка ичиндеги эритмеден чыгарылат. Патч пипеткасына амфотерицин камтылган ички эритме (болжол менен 200дөн 250 мкг/млге чейин; G4888, Sigma-Aldrich) толтурулуп, тешилген патч жазуусун алыңыз. Амфотерицин диметилсульфоксидде эритилген (акыркы концентрациясы: 0.1ден 0.3кө чейин; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Колдонулган DMSO концентрациясы изилденген нейрондорго эч кандай олуттуу таасир эткен эмес. Шпилькалоо процессинде каналдын каршылыгы (Ra) тынымсыз көзөмөлдөнүп, Ra жана AP амплитудасы турукташкандан кийин (20-40 мүнөт) эксперимент башталган. Спонтандык активдүүлүк чыңалуу жана/же ток кыскычында 2ден 5 мүнөткө чейин өлчөнөт. Маалыматтарды талдоо Igor Pro (7.05.2 версиясы, WaveMetrics, АКШ), Excel (2010 версиясы, Microsoft Corporation, Редмонд, АКШ) жана GraphPad Prism (8.1.2 версиясы, GraphPad Software Inc., Ла-Холья, Калифорния) программаларын колдонуу менен жүргүзүлдү. Спонтандык APтерди аныктоо үчүн IgorPro компаниясынын NeuroMatic v3.0c плагини колдонулат. Ар бир жазуу үчүн өзүнчө туураланган берилген босогону колдонуп, APтерди автоматтык түрдө аныктаңыз. Шпилька аралыгын колдонуп, шпилька жыштыгын максималдуу заматта шпилька жыштыгы жана орточо шпилька жыштыгы менен аныктаңыз.
PN бөлүп алуу. Мурда жарыяланган протоколго ылайыкташтыруу менен, PNлер чычкандын мээчесинен белгилүү бир этапта тазаланган (58). Кыскасы, мээче муздак диссоциация чөйрөсүндө [HBSS Ca2+ жана Mg2+ кошулбаган, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 U/мл) жана стрептомицин (0,05 мг/мл) кошулган] бөлүнүп, майдаланган, андан кийин чөйрө папаинде [HBSS, 1-цистеин·HCl (1 мг/мл), папаин (16 U/мл) жана дезоксирибонуклеаза I (DNase I; 0,1 мг/мл) кошулган] сиңирилген. 30°C температурада 30 мүнөт дарыланган. Алгач ткандарды жумуртканын былжырын (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) жана DNase (0,1 мг/мл) камтыган HBSS чөйрөсүндө ферменттик сиңирүүнүн алдын алуу үчүн бөлмө температурасында жууңуз, андан кийин 20 мМ глюкозасы бар HBSS чөйрөсүндө HBSSте акырын майдалап, пенициллинди (50 U/мл), стрептомицинди (0,05 мг/мл) жана DNase (0,1 мг/мл) бөлүп чыгарыңыз. Алынган клетка суспензиясы 70 мкм клетка чыпкасынан чыпкаланып, андан кийин клеткалар центрифугалоо (1110 айн/мин, 5 мүнөт, 4°C) менен майдаланып, сорттоочу чөйрөдө [HBSS, 20 мМ глюкоза, 20% түйүлдүк уйдун эритмеси менен толукталган) кайра эритилген. Кан сары суусу, пенициллин (50 U/мл) жана стрептомицин (0,05 мг/мл)]; клетканын жашоого жөндөмдүүлүгүн пропидий йодиди менен баалап, клетканын тыгыздыгын 1×106дан 2×106 клетка/млге чейин тууралаңыз. Агым цитометриясынан мурун, суспензия 50 мкм клеткалык чыпка аркылуу чыпкаланган.
Агым цитометри. Клеткаларды сорттоо 4°C температурада FACSAria III машинасын (BD Biosciences) жана FACSDiva программасын (BD Biosciences, 8.0.1 версиясы) колдонуу менен жүргүзүлдү. Клетка суспензиясы 100 мкм сопло менен 20 psi басым астында секундасына ~2800 окуя ылдамдыгында сорттолгон. Салттуу дарбазалоо критерийлери (клетканын өлчөмү, бимодалдык айырмалоо жана чачыратуу мүнөздөмөлөрү) PNди башка клетка түрлөрүнөн туура бөлүп алууну камсыздай албагандыктан, дарбазалоо стратегиясы mitoYFP+ ​​​​жана башкаруу mitoYFP − чычкандарындагы YFP интенсивдүүлүгүн жана автофлуоресценциясын түздөн-түз салыштыруунун негизинде белгиленет. YFP үлгүнү 488 нм лазердик линия менен нурландыруу менен козголот жана сигнал 530/30 нм тилкелүү өткөргүч чыпкасын колдонуу менен аныкталат. mitoYFP+ ​​чычкандарында Rosa26-mitoYFP репортер генинин салыштырмалуу күчү нейрон денесин жана аксон фрагменттерин айырмалоо үчүн да колдонулат. 7-AAD 561 нм сары лазер менен дүүлүктүрүлөт жана өлгөн клеткаларды чыгарып салуу үчүн 675/20 нм тилкелүү чыпка менен аныкталат. Астроциттерди бир эле учурда бөлүү үчүн клетка суспензиясы ACSA-2-APC менен боёлгон, андан кийин үлгү 640 нм лазер сызыгы менен нурландырылган жана сигналды аныктоо үчүн 660/20 нм тилкелүү чыпка колдонулган.
Чогултулган клеткалар центрифугалоо жолу менен гранулдандырылып (1110 айн/мин, 5 мүнөт, 4°C), колдонулганга чейин -80°C температурада сакталган. Mfn2cKO чычкандары жана алардын күчүктөрү процедуралык өзгөрмөлүүлүктү минималдаштыруу үчүн ошол эле күнү классификацияланган. FACS маалыматтарын көрсөтүү жана талдоо FlowJo программасын (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) колдонуу менен жүргүзүлдү.
Жогоруда айтылгандай (59), реалдуу убакыттагы ПЦР кийинчерээк мтДНКны сандык жактан аныктоо үчүн сорттолгон нейрондордон ДНКны бөлүп алуу үчүн колдонулат. Сызыктуулугу жана босоголук сезгичтиги башында ар кандай сандагы клеткаларда qPCRди иштетүү менен текшерилген. Кыскасы, 50 мМ трис-HCl (рН 8.5), 1 мМ EDTA, 0.5% Tween 20 жана протеиназа K (200 нг/мл) камтыган лизис буферине 300 PN чогултуп, 55°C температурада 120 мүнөт инкубациялаңыз. Протеиназа K толук инактивдештирилишин камсыз кылуу үчүн клеткалар андан ары 95°C температурада 10 мүнөт инкубацияланган. mt-Nd1ге мүнөздүү TaqMan зондун (Thermo Fisher) колдонуп, мтДНК 7900HT Real-Time ПЦР системасында (Thermo Fisher Scientific) жарым-жартылай сандык ПЦР менен өлчөнгөн. Science, каталог номери Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталог номери AIVI3E8) жана 18S (Thermo Fisher Scientific, каталог номери Hs99999901_s1) гендери.
Протеом үлгүсүн даярдоо. Эритмени 95°C температурада 10 мүнөт ысытып жана ультраүн менен иштетүү аркылуу лизис буферинде [6 М гуанидин хлориди, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлориди, 10 мМ хлорацетамид жана 100 мМ трис- HClдеги тоңдурулган нейрон гранулдарын лизиске киргизет]. Bioruptor (Diagenode) 10 мүнөт (30 секунд импульс / 30 секунд тыныгуу мезгили) боюнча жүргүзүлдү. Үлгү 20 мМ трис-HCl (рН 8.0) эритмесинде 1:10 катышында суюлтулуп, 300 нг трипсин алтыны (Promega) менен аралаштырылып, толук сиңирүү үчүн 37°C температурада түнү бою инкубацияланган. Экинчи күнү үлгү 20 000 г температурада 20 мүнөт центрифугаланган. Үстүнкү катмар 0,1% кумурска кислотасы менен суюлтулуп, эритме өз алдынча жасалган StageTips менен тузсуздандырылган. Үлгү SpeedVac инструментинде (Eppendorf концентратору плюс 5305) 45°C температурада кургатылган, андан кийин пептид 0,1% кумурска кислотасында суспензияланган. Бардык үлгүлөр бир эле учурда бир адам тарабынан даярдалган. Астроцит үлгүлөрүн анализдөө үчүн, 4 мкг тузсуздандырылган пептиддер тандем массалык белгиси (TMT10plex, каталог номери 90110, Thermo Fisher Scientific) менен пептиддин TMT реагентине катышы 1:20 болгон белгиленди. TMT белгилөө үчүн 0,8 мг TMT реагенти 70 мкл суусуз ACNде кайра эритилип, кургатылган пептид 9 мкл 0,1 M TEAB (триэтиламмоний бикарбонаты) болуп кайра калыбына келтирилген, ага ACNдеги 7 мкл TMT реагенти кошулган. Концентрациясы 43,75% түзгөн. 60 мүнөт инкубациядан кийин реакция 2 мкл 5% гидроксиламин менен басылган. Белгиленген пептиддер чогултулуп, кургатылган, 200 мкл 0,1% кумурска кислотасында (FA) кайра эритилип, экиге бөлүнүп, андан кийин өз алдынча жасалган StageTips аркылуу тузсуздандырылган. UltiMate 3000 өтө жогорку өндүрүмдүүлүктөгү суюк хроматографын (UltiMate 3000 өтө жогорку өндүрүмдүүлүктөгү суюк хроматограф) колдонуп, эки жарымынын бири 130Å1,7μm C18 бөлүкчөлөрү менен толтурулган 1мм x 150мм Acquity хроматографиялык колонкасында фракцияланган (Waters, каталог № SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Пептиддерди 30 мкл/мин агым ылдамдыгында бөлүп, 1% дан 50% га чейинки буфер Вден 85 мүнөткө бөлүп, 96 мүнөт баскычтуу градиент менен, 50% дан 95% га чейинки буфер Вден 3 мүнөткө, андан кийин 95% буфер В үчүн 8 мүнөт кармаңыз; А буфери 5% ACN жана 10 мМ аммоний бикарбонатынан (ABC), ал эми В буфери 80% ACN жана 10 мМ ABCден турат. Ар бир 3 мүнөт сайын фракцияларды чогултуп, аларды эки топко бириктириңиз (1 + 17, 2 + 18 ж.б.) жана вакуумдук центрифугада кургатыңыз.
LC-MS/MS анализи. Массалык спектрометрия үчүн пептиддер (r119.aq номери) 1,9 мкм ReproSil-Pur 120 C18-AQ чөйрөсү (Dr. Maisch, mat) менен жабдылган 25 см, 75 мкм ички диаметрдеги PicoFrit аналитикалык колонкасында (жаңы объективдүү линза, тетиктин номери PF7508250) бөлүнгөн, Use EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Германия). Колонна 50°C температурада кармалган. А жана В буферлери тиешелүүлүгүнө жараша суудагы 0,1% кумурска кислотасынан жана 80% ACNдеги 0,1% кумурска кислотасынан турат. Пептиддер 6%дан 31%га чейин B буферинен 65 мүнөткө жана 31%дан 50%га чейин B буферинен 5 мүнөткө 200 нл/мин градиенти менен бөлүнгөн. Элюцияланган пептиддер Orbitrap Fusion массалык спектрометринде (Thermo Fisher Scientific) талданган. Пептид прекурсорунун m/z өлчөө 350дөн 1500 м/зге чейинки диапазондо 120 000 чечилиште жүргүзүлөт. 27% нормалдаштырылган кагылышуу энергиясын колдонуп, жогорку энергиялуу C тузак диссоциациясынын (HCD) бөлүнүшү үчүн 2ден 6га чейинки заряд абалы бар эң күчтүү прекурсор тандалып алынган. Цикл убактысы 1 с деп коюлган. Пептид фрагментинин m/z мааниси ион тузактагы эң кичинекей AGC бутасын 5×104 жана максималдуу инъекция убактысын 86 мс колдонуу менен өлчөнгөн. Фрагментациядан кийин, прекурсор 45 с динамикалык четтетүү тизмесине киргизилген. TMT менен белгиленген пептиддер 50 см, 75 мкм Acclaim PepMap тилкесинде (Thermo Fisher Scientific, каталог номери 164942) бөлүнгөн, ал эми миграция спектрлери жогорку талаалуу асимметриялык толкун формасынын иондору (FAIMS) менен жабдылган Orbitrap Lumos Tribrid массалык спектрометринде (Thermo Fisher Scientific) талданган (Thermo Fisher Scientific), ал −50 жана −70 В эки компенсациялык чыңалууда иштейт. Синхрондоштуруучу прекурсордун негизинде тандалган MS3 TMT отчетунун иондук сигналын өлчөө үчүн колдонулат. Пептиддерди бөлүү EASY-nLC 1200дө 90% сызыктуу градиент элюциясын колдонуу менен, буфердин концентрациясы 6% дан 31% га чейин болгон; А буфери 0,1% FA, ал эми В буфери 0,1% FA жана 80% ACN болгон. Аналитикалык тилке 50°C температурада иштейт. FAIMS компенсациялык чыңалуусуна ылайык баштапкы файлды бөлүү үчүн FreeStyle (1.6 версиясы, Thermo Fisher Scientific) колдонуңуз.
Белокту идентификациялоо жана сандык аныктоо. Интеграцияланган Andromeda издөө системасын колдонуу менен баштапкы маалыматтар MaxQuant 1.5.2.8 версиясын (https://maxquant.org/) колдонуп талданды. Aequorea victoriaдан алынган Cre рекомбиназа жана YFP ырааттуулуктарынан тышкары, чычкандын шилтеме протеомунун (Proteome ID UP000000589, UniProtтон 2017-жылдын май айында жүктөлүп алынган) канондук ырааттуулугу жана изоформалык ырааттуулугу үчүн пептиддик фрагменттин спектрлери изделди. Метиониндин кычкылдануусу жана белоктун N-терминалдык ацетилдениши өзгөрүлмө модификациялар катары коюлган; цистеин карбамойл метилдениши туруктуу модификациялар катары коюлган. Тамак сиңирүү параметрлери "спецификалык" жана "трипсин/P" деп коюлган. Белокту идентификациялоо үчүн колдонулган пептиддердин жана устара пептиддеринин минималдуу саны 1; уникалдуу пептиддердин минималдуу саны 0. Пептиддик картаны дал келтирүү шартында белокту идентификациялоо ылдамдыгы 0,01 болгон. "Экинчи пептид" опциясы иштетилген. Ар кандай баштапкы файлдардын ортосунда ийгиликтүү идентификацияларды өткөрүү үчүн "иштетүүлөрдүн ортосундагы дал келүү" опциясын колдонуңуз. Белгисиз сандык аныктоо (LFQ) үчүн LFQ минималдуу катышынын санын 1 колдонуңуз (60). LFQ интенсивдүүлүгү ар бир убакыт чекитинде жок дегенде бир генотип тобунда жок дегенде эки жарактуу маани үчүн чыпкаланат жана туурасы 0,3 жана 1,8 ылдый жылган нормалдуу бөлүштүрүүдөн экстраполяцияланат. LFQ жыйынтыктарын талдоо үчүн Perseus эсептөө платформасын (https://maxquant.net/perseus/) жана R (https://r-project.org/) колдонуңуз. Дифференциалдык экспрессияны талдоо үчүн limma программалык пакетинен эки тараптуу орточо t тести колдонулган (61). Изилдөөчү маалыматтарды талдоо ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally жана pheatmap колдонуу менен жүргүзүлөт. TMTге негизделген протеомика маалыматтары MaxQuant 1.6.10.43 версиясын колдонуп талданды. UniProt компаниясынын 2018-жылдын сентябрь айында жүктөлүп алынган адам протеомикасы боюнча маалымат базасынан чийки протеомика маалыматтарын издеңиз. Анализге өндүрүүчү тарабынан берилген изотоптун тазалыгын оңдоо коэффициенти кирет. Дифференциалдык экспрессияны анализдөө үчүн R тилиндеги limma колдонуңуз. Баштапкы маалыматтар, маалымат базасын издөө натыйжалары жана маалыматтарды анализдөөнүн жумуш агымы жана натыйжалары PRIDE өнөктөштүк репозиторийи аркылуу ProteomeXchange альянсында PXD019690 маалымат топтомунун идентификатору менен сакталат.
Функционалдык аннотациялар анализди байытат. 8 жумадагы маалыматтар топтомунун функционалдык аннотация терминдеринин байлыгын аныктоо үчүн Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) куралы колдонулган (1-сүрөт). Кыскасы, LC-MS/MS (тандемдик массалык спектрометрия) маалыматтарын анализдөөдөн алынган сандык белок тизмеси төмөнкү чыпкалоо критерийлери менен колдонулат: Mus musculus түр жана фон катары тандалып алынат жана категория Benjaminini тарабынан 0,05 же андан төмөн байытуу үчүн туураланган P мааниси маанилүү деп эсептелет. Бул график үчүн ар бир кластердеги туураланган P маанисине негизделген эң жогорку беш ашыкча категория көрсөтүлгөн. Benjaminini, Krieger жана Yekutieli (Q = 5%) эки баскычтуу сызыктуу күчөтүү программасын колдонуу менен бир нече t-тестти колдонуу менен ар бир категорияда аныкталган маанилүү талапкерлер боюнча убакыт курсу боюнча белок экспрессиясынын анализи жүргүзүлөт жана ар бир сап өзүнчө талданат. Ырааттуу SD кабыл алуунун кажети жок.
Бул изилдөөнүн жыйынтыктарын жарыяланган маалымат базалары менен салыштыруу жана 1-сүрөттө Венн диаграммасын түзүү үчүн, биз сандык белок тизмесин MitoCarta 2.0 аннотациялары менен айкалыштырдык (24). Диаграмманы түзүү үчүн Draw Venn Diagram онлайн куралын (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) колдонуңуз.
Протеомика анализи үчүн колдонулган статистикалык процедуралар жөнүндө толук маалымат алуу үчүн, "Материалдар жана методдор" бөлүмүнө кайрылыңыз. Башка бардык эксперименттер үчүн толук маалыматты тиешелүү легендадан тапса болот. Эгерде башкача көрсөтүлбөсө, бардык маалыматтар орточо ± SEM катары көрсөтүлөт жана бардык статистикалык анализдер GraphPad Prism 8.1.2 программасын колдонуу менен жүргүзүлдү.
Бул макала боюнча кошумча материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 дарегинен караңыз.
Бул Creative Commons Attribution-Non-Commercial License шарттары боюнча таратылган ачык жеткиликтүү макала, ал каалаган каражатта колдонууга, таратууга жана көчүрүүгө мүмкүндүк берет, эгерде акыркы колдонуу коммерциялык пайда үчүн болбосо жана түпнуска чыгарма туура болсо. Шилтеме.
Эскертүү: Биз сизден электрондук почта дарегиңизди берүүнү гана суранабыз, ошондо сиз баракчага сунуштаган адам сиз электрондук катты көрүшүн каалаарыңызды жана ал спам эмес экенин билет. Биз эч кандай электрондук почта даректерин кармабайбыз.
Бул суроо сиздин конок экениңизди текшерүү жана спамдын автоматтык түрдө жөнөтүлүшүнүн алдын алуу үчүн колдонулат.
Э.Мотори, И.Атанасов, СМВ Кочан, К.Фольц-Донахуэ, В.Сактивелу, П.Диавалиско, Н.Тони, Дж.Пуйал, Н.-Г. Ларсон
Дисфункцияланган нейрондордун протеомикасын анализдөө метаболикалык программалар нейродегенерацияга каршы туруу үчүн активдешээрин көрсөттү.
Э.Мотори, И.Атанасов, СМВ Кочан, К.Фольц-Донахуэ, В.Сактивелу, П.Диавалиско, Н.Тони, Дж.Пуйал, Н.-Г. Ларсон
Дисфункцияланган нейрондордун протеомикасын анализдөө метаболикалык программалар нейродегенерацияга каршы туруу үчүн активдешээрин көрсөттү.
©2020 Илимди өнүктүрүү боюнча Америка Ассоциациясы. бардык укуктар корголгон. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef жана COUNTERдин өнөктөшү. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.