Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы натыйжаларга жетүү үчүн, браузериңиздин жаңы версиясын колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде Шайкештик режимин өчүрүп коюңуз). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдештирбестен же JavaScriptсиз көрсөтүп жатабыз.
Пропион кислотасы (ППА) аутизм спектринин бузулушу сыяктуу нейроөнүгүү бузулууларындагы митохондриялык дисфункциянын ролун изилдөө үчүн колдонулат. ППА митохондриялык биогенезди, зат алмашууну жана алмашууну бузары белгилүү. Бирок, ППАнын митохондриялык динамикага, бөлүнүүгө жана биригүүгө тийгизген таасири бул механизмдердин татаал убакыттык мүнөзүнөн улам көйгөйлүү бойдон калууда. Бул жерде биз ППАнын нейрон сымал SH-SY5Y клеткаларындагы митохондриялык ультрастутурага, морфологияга жана динамикага кандай таасир этерин изилдөө үчүн кошумча сандык сүрөткө тартуу ыкмаларын колдонобуз. ППА (5 мМ) митохондриялык аянттын (p < 0,01), Фереттин диаметринин жана айланасынын (p < 0,05) жана 2-аймактын (p < 0,01) олуттуу азайышына алып келди. Митохондриялык окуялардын локаторун талдоо бөлүнүү жана биригүү окуяларынын олуттуу көбөйүшүн (p < 0,05) көрсөттү, ошону менен стресс шарттарында митохондриялык тармактын бүтүндүгүн сактап калды. Мындан тышкары, cMYC (p <0.0001), NRF1 (p <0.01), TFAM (p <0.05), STOML2 (p <0.0001) жана OPA1 (p <0.05) мРНК экспрессиясы бир кыйла төмөндөгөн. 01). Бул стресс шарттарында функцияны сактоо үчүн митохондриялык морфологиянын, биогенездин жана динамиканын кайра түзүлүшүн көрсөтөт. Биздин маалыматтар PPAнын митохондриялык динамикага тийгизген таасирин жаңыча түшүнүүгө мүмкүндүк берет жана митохондриялык стресстик реакцияларга катышкан татаал жөнгө салуу механизмдерин изилдөө үчүн сүрөткө тартуу ыкмаларынын пайдалуулугун баса белгилейт.
Митохондриялар энергия өндүрүү жана биосинтездеги типтүү ролдорунан тышкары ар кандай клеткалык функциялардын ажырагыс катышуучулары болуп саналат. Митохондриялык метаболизм кальций сигнализациясынын, зат алмашуу жана кычкылдануу-калыбына келүү гомеостазынын, сезгенүү сигнализациясынын, эпигенетикалык модификациялардын, клеткалардын көбөйүшүнүн, дифференциациясынын жана программаланган клетка өлүмүнүн негизги жөнгө салуучусу болуп саналат1. Атап айтканда, митохондриялык метаболизм нейрондордун өнүгүшү, жашоосу жана функциясы үчүн абдан маанилүү жана нейропатологиянын ар кандай көрүнүштөрүнө кеңири катышат2,3,4.
Акыркы он жылдыкта зат алмашуу статусу нейрогенездин, дифференциациянын, жетилүүнүн жана пластикалуулуктун борбордук жөнгө салуучусу катары пайда болду5,6. Жакында митохондриялык морфология жана динамика митоздун өзгөчө маанилүү компоненттерине айланды, бул клеткалардын ичинде дени сак митохондриялардын пулун сактап турган динамикалык процесс. Митохондриялык динамика митохондриялык биогенезден жана биоэнергетикадан митохондриялык бөлүнүүгө, биригүүгө, ташуу жана тазалоого чейинки татаал өз ара көз каранды жолдор менен жөнгө салынат7,8. Бул интегративдик механизмдердин кайсынысынын болбосун бузулушу дени сак митохондриялык тармактардын сакталышына тоскоол болот жана нейроөнүгүү үчүн терең функционалдык кесепеттерге алып келет9,10. Чынында эле, митохондриялык динамикасынын бузулушу көптөгөн психиатриялык, нейродегенеративдик жана нейроөнүгүү бузулууларында, анын ичинде аутизм спектринин бузулууларында (ASD) байкалат11,12.
АСД – татаал генетикалык жана эпигенетикалык архитектурасы бар гетерогендик нейроөнүгүү бузулушу. АСДнын тукум куучулук касиети талашсыз, бирок анын негизги молекулярдык этиологиясы начар изилденген. Клиникага чейинки моделдерден, клиникалык изилдөөлөрдөн жана көп омикалуу молекулярдык маалыматтар топтомдорунан топтолгон маалыматтар АСДда митохондриялык дисфункциянын көбүрөөк далилдерин берет13,14. Биз мурда АСД менен ооругандардын когортасында геном боюнча ДНК метилденүү скринингин жүргүзүп, митохондриялык метаболикалык жолдор боюнча топтолгон дифференциалдуу метилденген гендерди аныктадык15. Кийинчерээк биз митохондриялык биогенездин жана динамикасынын борбордук жөнгө салуучуларынын дифференциалдуу метилденүүсү жөнүндө кабарладык, бул mtДНК көчүрмөсүнүн санынын көбөйүшү жана ASD16да зааранын метаболикалык профилинин өзгөрүшү менен байланыштуу болгон. Биздин маалыматтар митохондриялык динамиканын жана гомеостаздын АСДнын патофизиологиясында борбордук ролду ойной тургандыгынын көбүрөөк далилдерин берет. Ошондуктан, митохондриялык динамика, морфология жана функциянын ортосундагы байланышты механикалык жактан түшүнүүнү жакшыртуу экинчилик митохондриялык дисфункция менен мүнөздөлгөн неврологиялык ооруларды изилдөөнүн негизги максаты болуп саналат.
Молекулярдык ыкмалар көбүнчө митохондриялык стресстик реакциялардагы белгилүү бир гендердин ролун изилдөө үчүн колдонулат. Бирок, бул ыкма митоздук башкаруу механизмдеринин көп кырдуу жана убакыттык мүнөзү менен чектелиши мүмкүн. Андан тышкары, митохондриялык гендердин дифференциалдык экспрессиясы функционалдык өзгөрүүлөрдүн кыйыр көрсөткүчү болуп саналат, айрыкча, адатта, чектелүү сандагы гендер гана талдангандыктан. Ошондуктан, митохондриялык функцияны жана биоэнергетиканы изилдөө үчүн түз ыкмалар сунушталган17. Митохондриялык морфология митохондриялык динамика менен тыгыз байланышта. Митохондриялык форма, байланыш жана түзүлүш энергия өндүрүү жана митохондриялык жана клеткалардын жашоосу үчүн абдан маанилүү5,18. Андан тышкары, митохондриялык морфологиядагы өзгөрүүлөргө көңүл бурат, алар митохондриялык дисфункциянын пайдалуу акыркы чекиттери катары кызмат кылышы мүмкүн жана кийинки механистикалык изилдөөлөр үчүн негиз болуп берет.
Митохондриялык морфологияны трансмиссиялык электрондук микроскопия (TEM) аркылуу түздөн-түз байкоого болот, бул клеткалык ультрастуруктураны деталдуу изилдөөгө мүмкүндүк берет. TEM клетка популяцияларындагы ген транскрипциясына, белок экспрессиясына же митохондриялык функционалдык параметрлерге гана таянбастан, жеке митохондриялыктардын чечилишинде митохондриялык кристалдардын морфологиясын, формасын жана түзүлүшүн түздөн-түз визуалдаштырат17,19,20. Мындан тышкары, TEM митохондриялык функцияда жана гомеостазда негизги ролду ойногон эндоплазмалык торчо жана аутофагосомалар сыяктуу башка органеллалардын өз ара аракеттенүүсүн изилдөөгө көмөктөшөт21,22. Ошентип, бул TEMди белгилүү бир жолдорго же гендерге көңүл буруудан мурун митохондриялык дисфункцияны изилдөө үчүн жакшы башталыш чекитине айлантат. Митохондриялык функция нейропатология үчүн барган сайын актуалдуу болуп бара жаткандыктан, митохондриялык морфологияны жана динамиканы in vitro нейрондук моделдерде түздөн-түз жана сандык жактан изилдөө мүмкүнчүлүгүнө ээ болуу зарылдыгы айкын болуп калды.
Бул макалада биз аутизм спектринин бузулушундагы митохондриялык дисфункциянын нейрондук моделиндеги митохондриялык динамиканы карайбыз. Биз мурда митохондриялык пропионил-КоА карбоксилаза ферментинин PCC суббирдиги болгон ASD15те пропионил-КоА карбоксилаза бета (PCCB) дифференциалдык метилдениши жөнүндө кабарлаганбыз. PCCнин бузулушу пропион кислотасын (PPA) кошо алганда, пропионил туундуларынын уулуу топтолушуна алып келери белгилүү23,24,25. PPA нейрондордун метаболизмин бузуп, жүрүм-турумду in vivo өзгөртөөрү көрсөтүлгөн жана ASD26,27,28ге катышкан нейроөнүгүү механизмдерин изилдөө үчүн аныкталган жаныбарлардын модели болуп саналат. Мындан тышкары, PPA митохондриялык мембрананын потенциалын, биогенезин жана дем алууну in vitro бузары кабарланган жана нейрондордогу митохондриялык дисфункцияны моделдөө үчүн кеңири колдонулган29,30. Бирок, PPA тарабынан индукцияланган митохондриялык дисфункциянын митохондриялык морфологияга жана динамикага тийгизген таасири азырынча начар түшүнүктүү.
Бул изилдөө SH-SY5Y клеткаларындагы митохондриялык морфологияга, динамикага жана функцияга PPAнын таасирин сандык жактан баалоо үчүн кошумча сүрөткө тартуу ыкмаларын колдонот. Биринчиден, биз митохондриялык морфологиядагы жана ультраструктурадагы өзгөрүүлөрдү визуалдаштыруу үчүн TEM ыкмасын иштеп чыктык17,31,32. Митохондриянын33 динамикалык мүнөзүн эске алуу менен, биз ошондой эле PPA стресси астында бөлүнүү жана биригүү окуяларынын, митохондриялык сандын жана көлөмдүн ортосундагы баланстын өзгөрүүлөрүн сандык жактан баалоо үчүн митохондриялык окуялардын локализаторун (MEL) анализин колдондук. Акырында, биз митохондриялык морфология жана динамиканын биогенезге, бөлүнүүгө жана биригүүгө катышкан гендердин экспрессиясындагы өзгөрүүлөр менен байланышы бар-жогун изилдедик. Жалпысынан алганда, биздин маалыматтар митохондриялык динамиканы жөнгө салуучу механизмдердин татаалдыгын аныктоо кыйынчылыгын көрсөтөт. Биз SH-SY5Y клеткаларындагы митохондриялык морфологияны изилдөөдө TEMдин пайдалуулугун баса белгилейбиз. Мындан тышкары, биз TEM маалыматтары зат алмашуу стрессине жооп катары динамикалык окуяларды чагылдырган сүрөткө тартуу ыкмалары менен айкалышканда эң бай маалыматты берерин баса белгилейбиз. Нейрон клеткаларынын митозун колдогон молекулярдык жөнгө салуу механизмдерин андан ары мүнөздөө нерв системасынын митохондриялык компоненти жана нейродегенеративдик оорулары жөнүндө маанилүү түшүнүк бере алат.
Митохондриялык стрессти пайда кылуу үчүн SH-SY5Y клеткалары 3 мМ жана 5 мМ натрий пропионатын (NaP) колдонуу менен PPA менен иштетилген. TEMге чейин үлгүлөр жогорку басымдагы тоңдуруу жана тоңдуруу аркылуу криогендик үлгү даярдоого дуушар болгон (1a-сүрөт). Биз үч биологиялык кайталоолор боюнча митохондриялык популяциялардын сегиз морфологиялык параметрлерин өлчөө үчүн автоматташтырылган митохондриялык сүрөт талдоо түтүгүн иштеп чыктык. PPA менен дарылоо төрт параметрди олуттуу өзгөрткөнүн аныктадык: 2-аянт, аянт, периметр жана Фереттин диаметри (1b–e-сүрөт). 2-аянт 3 мМ жана 5 мМ PPA менен дарылоодо бир кыйла азайган (тиешелүүлүгүнө жараша p = 0,0183 жана p = 0,002) (1b-сүрөт), ал эми аянт (p = 0,003), периметр (p = 0,0106) жана Фереттин диаметри бир кыйла азайган. Контролдук топко салыштырмалуу 5 мМ дарылоо тобунда бир кыйла азайган (p = 0,0172) болгон (1c–e-сүрөт). Аянттын жана айлананын олуттуу кыскарышы 5 мМ PPA менен дарыланган клеткаларда митохондриялар кичирээк, тегеректелген экенин жана бул митохондриялар контролдук клеткалардагыга караганда азыраак узун экенин көрсөттү. Бул ошондой эле Ферет диаметринин олуттуу төмөндөшү менен шайкеш келет, бул бөлүкчөлөрдүн четтеринин ортосундагы эң чоң аралыктын азайышын көрсөткөн көз карандысыз параметр. Кристалардын ультрастурулушундагы өзгөрүүлөр байкалды: PPA стрессинин таасири астында кристаллдар анча байкалбай калды (1a-сүрөт, B панели). Бирок, бардык эле сүрөттөр кристаллдардын ультрастурулушун так чагылдырган эмес, ошондуктан бул өзгөрүүлөрдүн сандык анализи жүргүзүлгөн эмес. Бул TEM маалыматтары үч мүмкүн болгон сценарийди чагылдырышы мүмкүн: (1) PPA бөлүнүүнү күчөтөт же биригүүнү токтотот, бул бар болгон митохондриялардын өлчөмүнүн кичирейишине алып келет; (2) биогенездин күчөшү жаңы, кичирээк митохондрияларды түзөт же (3) эки механизмди тең бир убакта индукциялайт. Бул шарттарды TEM менен айырмалоого мүмкүн болбосо да, олуттуу морфологиялык өзгөрүүлөр митохондриялык гомеостаздын жана PPA стресси астында динамикадагы өзгөрүүлөрдү көрсөтөт. Кийинчерээк биз бул динамиканы жана алардын негизиндеги потенциалдуу механизмдерди андан ары мүнөздөө үчүн кошумча параметрлерди изилдедик.
Пропион кислотасы (PPA) митохондриялык морфологияны кайра түзөт. (а) PPA менен дарылоонун көбөйүшү менен митохондриянын өлчөмүнүн кичирейип, митохондриялардын кичирейип, тегеректелип калганын көрсөткөн репрезентативдик трансмиссиялык электрондук микроскопиянын (TEM) сүрөттөрү; тиешелүүлүгүнө жараша 0 мМ (даарыланбаган), 3 мМ жана 5 мМ. Кызыл жебелер митохондрияларды көрсөтөт. (b–e) 24 саат бою PPA менен дарыланган SH-SY5Y клеткалары TEM үчүн даярдалган жана натыйжалары Fiji/ImageJ колдонуу менен талданган. Сегиз параметрдин төртөө контролдук (даарыланбаган, 0 мМ PPA) жана дарыланган (3 мМ жана 5 мМ PPA) клеткалардын ортосунда олуттуу айырмачылыктарды көрсөттү. (b) 2-аймак, (c) Аянт, (d) Периметр, (e) Фереттин диаметри. Олуттуу айырмачылыктарды аныктоо үчүн дисперсиянын бир тараптуу анализи (контролдук жана дарылоо) жана Даннеттин көптүк салыштыруу тести колдонулган (p < 0,05). Маалымат чекиттери ар бир клетка үчүн орточо митохондриялык маанини, ал эми ката тилкелери орточо ± SEMди билдирет. Көрсөтүлгөн маалыматтар n = 3тү, ар бир кайталоого кеминде 24 уячаны билдирет; жалпысынан 266 сүрөт талданган; * p < 0.05ти, ** p < 0.01ди билдирет.
Митохондриялык динамиканын PPAга кандай жооп кайтарарын андан ары мүнөздөө үчүн, биз митохондрияларды тетраметилродамин этил эфири (TMRE) менен боёп, 3 жана 5 мМ PPAда 24 сааттан кийин митохондрияны локалдаштыруу жана сандык жактан аныктоо үчүн убакыттын өтүшү менен микроскопияны жана MEL анализин колдондук. Бөлүнүү жана биригүү окуяларын дарылоо. (2a-сүрөт). MEL анализинен кийин митохондриялык түзүлүштөрдүн санын жана алардын орточо көлөмүн сандык жактан аныктоо үчүн митохондриялар андан ары талданды. Биз 3 мМде [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] бөлүнүү окуяларынын санынын бир аз, бирок олуттуу өсүшүн байкадык, бул бөлүнүү [5.6 ± 0.3 (p < 0.05)) жана биригүү [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] жана биригүү [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] <0.05)] окуяларына салыштырмалуу 5 мМде бир кыйла көбөйгөн (3b-сүрөт). Митохондриянын саны 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] жана 5 мМ [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] экөөндө тең бир кыйла көбөйгөн (3c-сүрөт), ал эми ар бир митохондриялык түзүлүштүн орточо көлөмү өзгөрүүсүз калган (3c-сүрөт). 3d). Жалпысынан алганда, бул митохондриялык динамиканы кайра түзүү митохондриялык тармактын бүтүндүгүн ийгиликтүү сактаган компенсатордук жооп катары кызмат кылаарын көрсөтүп турат. 3 мМ PPAдагы бөлүнүү окуяларынын санынын көбөйүшү митохондриялык сандын көбөйүшү жарым-жартылай митохондриялык бөлүнүүгө байланыштуу экенин көрсөтүп турат, бирок митохондриянын орточо көлөмү негизинен өзгөрүүсүз калганын эске алганда, биогенезди кошумча компенсатордук жооп катары жокко чыгарууга болбойт. Бирок, бул маалыматтар TEM тарабынан байкалган кичирээк, тегерек митохондриялык түзүлүштөргө дал келет жана ошондой эле PPA тарабынан индукцияланган митохондриялык динамикадагы олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөтөт.
Пропион кислотасы (PPA) тармактын бүтүндүгүн сактоо үчүн динамикалык митохондриялык ремоделдөөнү индукциялайт. SH-SY5Y клеткалары өстүрүлүп, 24 саат бою 3 жана 5 мМ PPA менен иштетилип, TMRE жана Hoechst 33342 менен боёлгон, андан кийин MEL анализи жүргүзүлгөн. (а) Ар бир шарт үчүн 2-убакыттагы (t2) түстүү жана экилик максималдуу интенсивдүүлүк проекцияларын чагылдырган репрезентативдик убакыт аралык микроскопиялык сүрөттөр. Ар бир бинардык сүрөттө көрсөтүлгөн тандалган аймактар ​​убакыттын өтүшү менен динамиканы көрсөтүү үчүн үч башка убакыт аралыгында (t1-t3) 3D форматында жакшыртылып, көрсөтүлөт; биригүү окуялары жашыл түс менен белгиленген; бөлүнүү окуялары жашыл түс менен белгиленген. Кызыл түс менен көрсөтүлгөн. (б) Ар бир шарттагы динамикалык окуялардын орточо саны. (в) Ар бир клеткадагы митохондриялык структуралардын орточо саны. (г) Ар бир клеткадагы ар бир митохондриялык структуранын орточо көлөмү (µm3). Көрсөтүлгөн маалыматтар дарылоо тобуна n = 15 клетканы билдирет. Көрсөтүлгөн ката тилкелери орточо ± SEMди билдирет, масштаб тилкеси = 10 μm, * p < 0.05.
Пропион кислотасы (PPA) митохондриялык динамика менен байланышкан гендердин транскрипциялык басылышын шарттайт. SH-SY5Y клеткалары 24 саат бою 3 жана 5 мМ PPA менен дарыланган. Гендердин салыштырмалуу сандык аныктоосу RT-qPCR колдонуу менен жүргүзүлүп, B2Mге чейин нормалдаштырылган. Митохондриялык биогенез гендери (а) cMYC, (б) TFAM, (в) NRF1 жана (г) NFE2L2. Митохондриялык биригүү жана бөлүнүү гендери (д) STOML2, (ф) OPA1, (г) MFN1, (з) MFN2 жана (i) DRP1. Олуттуу айырмачылыктар (p < 0,05) бир тараптуу ANOVA (контролдоо жана дарылоо) жана Даннеттин көптүк салыштыруу тести аркылуу текшерилген: * p < 0,05ти, ** p < 0,01ди жана **** p < 0,0001ди билдирет. Сызыкчалар орточо экспрессияны ± SEMди билдирет. Көрсөтүлгөн маалыматтар n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) жана n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биологиялык кайталоолорду билдирет.
TEM жана MEL анализдеринин маалыматтары биргелешип PPA митохондриялык морфологияны жана динамиканы өзгөртөрүн көрсөтүп турат. Бирок, бул сүрөткө тартуу ыкмалары бул процесстерди башкарган негизги механизмдер жөнүндө түшүнүк бербейт. Ошондуктан, биз PPA дарылоосуна жооп катары митохондриялык динамиканын, биогенездин жана митоздун тогуз негизги жөнгө салуучусунун мРНК экспрессиясын изилдедик. Биз клеткалык миелома онкогенин (cMYC), ядролук дем алуу факторун (NRF1), митохондриялык транскрипция факторун 1 (TFAM), NFE2 сыяктуу транскрипция факторун BZIP (NFE2L2), гастрин сыяктуу белокту 2 (STOML2), көрүү нервинин атрофиясын 1 (OPA1), Митофусинди 1 (MFN1), Митофусинди 2 (MFN2) жана динаминге байланыштуу белокту 1 (DRP1) 3 мМ жана 5 мМ PPA менен 24 сааттык дарылоодон кийин сандык жактан аныктадык. Биз 3 мМ (p = 0,0053, p = 0,0415 жана p < 0,0001 тиешелүүлүгүнө жараша) жана 5 мМ (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA менен дарылоону байкадык. (3a–c-сүрөт). мРНК экспрессиясынын төмөндөшү дозага көз каранды болгон: cMYC, NRF1 жана TFAM экспрессиясы 3 мМде тиешелүүлүгүнө жараша 5,7, 2,6 жана 1,9 эсеге, ал эми 5 мМде 11,2, 3 жана 2,2 эсеге төмөндөгөн. Ал эми борбордук кычкылдануу-калыбына келүү биогенезинин NFE2L2 гени PPAнын эч кандай концентрациясында өзгөргөн эмес, бирок экспрессиянын төмөндөшүнүн дозага көз каранды тенденциясы окшош байкалган (3d-сүрөт).
Ошондой эле, биз бөлүнүү жана биригүүнү жөнгө салууга катышкан классикалык гендердин экспрессиясын изилдедик. STOML2 биригүүгө, митофагияга жана биогенезге катышат деп эсептелет жана анын экспрессиясы 3 мМ (2,4 эсе өзгөрүү) жана 5 мМ (2,8 эсе өзгөрүү) PPAга бир кыйла төмөндөгөн (p < 0,0001) (1-сүрөт). 3d-сүрөт). Ошо сыяктуу эле, OPA1 биригүү генинин экспрессиясы 3 мМ (1,6 эсе өзгөрүү) жана 5 мМ (1,9 эсе өзгөрүү) PPAда (тиешелүүлүгүнө жараша p = 0,006 жана p = 0,0024) төмөндөгөн (3f-сүрөт). Бирок, биз 24 сааттык PPA стресси астында MFN1, MFN2 биригүү гендеринин же DRP1 бөлүнүү генинин экспрессиясында олуттуу айырмачылыктарды тапкан жокпуз (3g–i-сүрөт). Мындан тышкары, биз төрт биригүү жана бөлүнүү белокторунун (OPA1, MFN1, MFN2 жана DRP1) деңгээли бирдей шарттарда өзгөргөн эместигин аныктадык (4a–d-сүрөт). Бул маалыматтар бир гана убакытты чагылдыраарын жана PPA стрессинин алгачкы этаптарындагы белок экспрессиясынын же активдүүлүк деңгээлинин өзгөрүшүн чагылдырбашы мүмкүн экенин белгилей кетүү маанилүү. Бирок, cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 жана OPA1 экспрессиясынын олуттуу төмөндөшү митохондриялык метаболизмдин, биогенездин жана динамиканын транскрипциялык жактан олуттуу бузулушун көрсөтүп турат. Мындан тышкары, бул маалыматтар митохондриялык функциянын акыркы абалдагы өзгөрүүлөрүн түздөн-түз изилдөө үчүн сүрөткө тартуу ыкмаларынын пайдалуулугун баса белгилейт.
Пропион кислотасы (PPA) менен дарылоодон кийин биригүү жана бөлүнүү факторунун белок деңгээли өзгөргөн жок. SH-SY5Y клеткалары 24 саат бою 3 жана 5 мМ PPA менен дарыланган. Белок деңгээли Вестерн-блот анализи менен сандык жактан аныкталып, экспрессия деңгээли жалпы белокко чейин нормалдаштырылган. Белоктун орточо экспрессиясы жана максаттуу жана жалпы белоктун репрезентативдик Вестерн-блоттору көрсөтүлгөн. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Сызыкчалар орточо ± SEMди билдирет, ал эми көрсөтүлгөн маалыматтар n = 3 биологиялык кайталоону билдирет. Бир тараптуу дисперсиялык анализ жана Даннетт тести аркылуу көп салыштыруулар (p < 0,05) жүргүзүлдү. Баштапкы гель жана блот S1 сүрөттө көрсөтүлгөн.
Митохондриялык дисфункция зат алмашуу, жүрөк-кан тамыр жана булчуң ооруларынан баштап неврологиялык ооруларга чейинки көп системалуу оорулар менен байланыштуу1,10. Көптөгөн нейродегенеративдик жана нейродегенеративдик оорулар митохондриялык дисфункция менен байланыштуу, бул мээнин өмүр бою бул органеллалардын маанисин баса белгилейт. Бул ооруларга Паркинсон оорусу, Альцгеймер оорусу жана ASD кирет3,4,18. Бирок, бул ооруларды изилдөө үчүн мээ ткандарына жетүү кыйын, айрыкча механикалык деңгээлде, бул клеткалык модель системаларын зарыл альтернатива кылат. Бул изилдөөдө биз нейрондук ооруларда, айрыкча аутизм спектринин бузулууларында байкалган митохондриялык дисфункцияны кайталоо үчүн PPA менен дарыланган SH-SY5Y клеткаларын колдонгон клеткалык модель системасын колдонобуз. Нейрондордогу митохондриялык динамиканы изилдөө үчүн бул PPA моделин колдонуу ASD этиологиясы жөнүндө түшүнүк бере алат.
Биз митохондриялык морфологиядагы өзгөрүүлөрдү көрүү үчүн TEMди колдонуу мүмкүнчүлүгүн изилдедик. Анын натыйжалуулугун максималдуу түрдө жогорулатуу үчүн TEMди туура колдонуу керектигин белгилей кетүү маанилүү. Крио-үлгүлөрдү даярдоо клеткалык компоненттерди бир эле учурда бекитүү жана артефакттардын пайда болушун азайтуу менен нейрондук түзүлүштөрдү жакшыраак сактоого мүмкүндүк берет34. Ушуга ылайык, биз нейрон сымал SH-SY5Y клеткаларында бүтүн субклеткалык органеллалар жана узун митохондриялар бар экенин байкадык (1a-сүрөт). Бул нейрондук клетка моделдеринде митохондриялык морфологияны изилдөө үчүн криогендик даярдоо ыкмаларынын пайдалуулугун баса белгилейт. TEM маалыматтарын объективдүү талдоо үчүн сандык өлчөөлөр абдан маанилүү болгону менен, митохондриялык морфологиялык өзгөрүүлөрдү ырастоо үчүн кандай конкреттүү параметрлерди өлчөө керектиги боюнча дагы эле бирдиктүү пикир жок. Митохондриялык морфологияны сандык жактан изилдеген көптөгөн изилдөөлөргө таянып17,31,32, биз сегиз морфологиялык параметрди, атап айтканда: аянт, аянт2, аспект катышы, периметр, тегеректик, градус, Фереттин диаметри жана тегеректикти өлчөөчү автоматташтырылган митохондриялык сүрөт талдоо түтүгүн иштеп чыктык.
Алардын арасында PPA аянты 2, аянт, периметр жана Ферет диаметрин бир кыйла азайткан (1b–e-сүрөт). Бул митохондрия кичирейип, тегеректелгенин көрсөттү, бул PPA30 тарабынан индукцияланган митохондриялык стресстен 72 саат өткөндөн кийин митохондриялык аянттын азайышын көрсөткөн мурунку изилдөөлөргө дал келет. Бул морфологиялык өзгөчөлүктөр митохондриялык бөлүнүүнү, митохондриялык тармактан бузулган компоненттерди бөлүп алуу жана алардын митофагия аркылуу деградациясын тездетүү үчүн зарыл болгон процессти көрсөтүшү мүмкүн35,36,37. Башка жагынан алганда, митохондриянын орточо өлчөмүнүн азайышы биогенездин жогорулашы менен байланыштуу болушу мүмкүн, бул кичинекей жаңы пайда болгон митохондриялардын пайда болушуна алып келет. Бөлүнүүнүн же биогенездин жогорулашы митохондриялык стресске каршы митозду сактоо үчүн компенсатордук жоопту билдирет. Бирок, митохондриянын өсүшүнүн төмөндөшү, биригүүнүн бузулушу же башка шарттарды жокко чыгарууга болбойт.
TEM тарабынан түзүлгөн жогорку чечилиштеги сүрөттөр жеке митохондриялардын деңгээлинде морфологиялык мүнөздөмөлөрдү аныктоого мүмкүндүк берсе да, бул ыкма бир эле учурда эки өлчөмдүү сүрөттөрдү берет. Зат алмашуу стрессине динамикалык жоопторду изилдөө үчүн биз митохондрияларды TMRE менен боёп, MEL анализи менен убакыт аралык микроскопиясын колдондук, бул убакыттын өтүшү менен митохондриялык тармактагы өзгөрүүлөрдү жогорку өндүрүмдүүлүктөгү 3D визуализациялоого мүмкүндүк берет33,38. Биз PPA стрессинин астында митохондриялык динамикадагы анча байкалбаган, бирок маанилүү өзгөрүүлөрдү байкадык (2-сүрөт). 3 мМде бөлүнүү окуяларынын саны бир кыйла көбөйдү, ал эми биригүү окуялары контролдогудай эле калды. 5 мМ PPAда бөлүнүү жана биригүү окуяларынын санынын көбөйүшү байкалды, бирок бул өзгөрүүлөр болжол менен пропорционалдуу болду, бул бөлүнүү жана биригүү кинетикасы жогорку концентрацияларда тең салмактуулукка жеткенин көрсөтүп турат (2b-сүрөт). Митохондриянын орточо көлөмү 3 жана 5 мМ PPAда өзгөрүүсүз калды, бул митохондриялык тармактын бүтүндүгү сакталып калганын көрсөтүп турат (2d-сүрөт). Бул динамикалык митохондриялык тармактардын тармактын фрагментациясына алып келбестен гомеостазды натыйжалуу сактоо үчүн жеңил метаболикалык стресске жооп берүү жөндөмүн чагылдырат. 3 мМ PPAда бөлүнүүнүн көбөйүшү жаңы тең салмактуулукка өтүүнү жеңилдетүү үчүн жетиштүү, бирок PPAнын жогорку концентрацияларынан улам пайда болгон стресске жооп катары тереңирээк кинетикалык кайра түзүү талап кылынат.
Митохондриянын саны эки PPA стресс концентрациясында тең көбөйгөн, бирок митохондриянын орточо көлөмү олуттуу өзгөргөн жок (2c-сүрөт). Бул биогенездин көбөйүшүнө же бөлүнүүнүн көбөйүшүнө байланыштуу болушу мүмкүн; бирок, митохондриянын орточо көлөмүнүн олуттуу төмөндөшү болбогондо, биосинтездин көбөйүшү ыктымал. Бирок, 2-сүрөттөгү маалыматтар эки компенсатордук механизмдин бар экендигин тастыктайт: митохондриялык бөлүнүүнүн жогорулашына шайкеш келген бөлүнүү окуяларынын санынын көбөйүшү жана митохондриялык биогенезге ылайык келген окуялардын санынын көбөйүшү. Акыр-аягы, жеңил стресс үчүн динамикалык компенсация бөлүнүүнү, биригүүнү, биогенезди жана митофагияны камтыган бир эле учурда жүрүүчү процесстерден турушу мүмкүн. Мурунку авторлор PPA митозду30,39 жана митофагияны29 күчөтөрүн көрсөтүшкөнү менен, биз PPAга жооп катары митохондриялык бөлүнүүнү жана биригүү динамикасын кайра түзүү үчүн далилдерди келтиребиз. Бул маалыматтар TEM тарабынан байкалган морфологиялык өзгөрүүлөрдү тастыктайт жана PPA тарабынан индукцияланган митохондриялык дисфункция менен байланышкан механизмдерди тереңирээк түшүнүүгө мүмкүндүк берет.
TEM да, MEL да анализдери байкалган морфологиялык өзгөрүүлөрдүн негизиндеги генди жөнгө салуучу механизмдердин түздөн-түз далилин бербегендиктен, биз митохондриялык метаболизмге, биогенезге жана динамикага катышкан гендердин РНК экспрессиясын изилдедик. cMYC протоонкогени митохондриянын, гликолиздин, аминокислоталардын жана май кислоталарынын метаболизминин жөнгө салынышына катышкан транскрипция фактору болуп саналат40. Мындан тышкары, cMYC митохондриялык транскрипцияга, трансляцияга жана комплекстүү чогултууга катышкан дээрлик 600 митохондриялык гендин, анын ичинде NRF1 жана TFAM41дин экспрессиясын жөнгө салаары белгилүү. NRF1 жана TFAM митоздун эки борбордук жөнгө салуучусу болуп саналат, алар PGC-1αнын ылдый жагында mtDNA репликациясын активдештирүү үчүн иштейт. Бул жол cAMP жана AMPK сигнализациясы менен активдештирилет жана энергия сарптоого жана метаболикалык стресске сезгич. Ошондой эле, биз PPAнын таасири кычкылдануу стресси менен байланыштуу болушу мүмкүнбү же жокпу, аныктоо үчүн митохондриялык биогенездин кычкылдануу-калыбына келүү жөнгө салуучусу NFE2L2ди изилдедик.
NFE2L2 экспрессиясы өзгөрүүсүз калганы менен, биз 3 мМ жана 5 мМ PPA менен 24 сааттык дарылоодон кийин cMYC, NRF1 жана TFAM экспрессиясынын дозага көз каранды төмөндөшүн байкадык (3a–c-сүрөт). cMYC экспрессиясынын төмөндөшү мурда митохондриялык стресске жооп катары кабарланган42 жана тескерисинче, cMYC экспрессиясынын төмөндөшү митохондриялык метаболизмди, тармактык байланышты жана мембрананын поляризациясын кайра түзүү менен митохондриялык дисфункцияга алып келиши мүмкүн43. Кызыктуусу, cMYC митохондриялык бөлүнүүнү жана биригүүнү жөнгө салууга да катышат42,43 жана клетканын бөлүнүшү учурунда DRP1 фосфорлануусун жана митохондриялык локализацияны күчөтөрү, ошондой эле нейрондук өзөк клеткаларында митохондриялык морфологиялык кайра түзүүгө ортомчулук кылаары белгилүү45. Чынында эле, cMYC жетишсиз фибробласттар PPA43 стрессинен улам пайда болгон өзгөрүүлөргө ылайык, митохондриялык өлчөмдөрдүн азайышын көрсөтөт. Бул маалыматтар cMYC менен митохондриялык динамика ортосундагы кызыктуу, бирок азырынча белгисиз байланышты көрсөтүп турат, бул PPA стрессинен улам пайда болгон кайра түзүүнүн келечектеги изилдөөлөрү үчүн кызыктуу максатты камсыз кылат.
NRF1 жана TFAMдын азайышы cMYCтин маанилүү транскрипциялык активатор катары ролуна шайкеш келет. Бул маалыматтар адамдын жоон ичеги рагынын клеткаларында жүргүзүлгөн мурунку изилдөөлөргө да шайкеш келет, анда PPA 22 сааттын ичинде NRF1 мРНК экспрессиясын азайтканы көрсөтүлгөн, бул АТФтин азайышы жана ROS46нын көбөйүшү менен байланышкан. Бул авторлор ошондой эле TFAM экспрессиясы 8,5 сааттан кийин жогорулаганын, бирок 22 сааттан кийин баштапкы деңгээлге кайтып келгенин билдиришкен. Ал эми Ким жана башкалар (2019) SH-SY5Y клеткаларында 4 сааттык PPA стрессинен кийин TFAM мРНК экспрессиясы бир кыйла төмөндөгөнүн көрсөтүшкөн; бирок, 72 сааттан кийин TFAM белок экспрессиясы бир кыйла жогорулаган жана мтДНК көчүрмөсүнүн саны бир кыйла көбөйгөн. Ошентип, 24 сааттан кийин биз байкаган митохондриялык биогенез гендеринин санынын азайышы митохондриянын санынын көбөйүшү биогенездин мурунку убакыт чекиттеринде активдешүүсү менен байланыштуу болушу мүмкүн экендигин жокко чыгарбайт. Мурунку изилдөөлөр көрсөткөндөй, PPA 4 саат 30 мүнөттө SH-SY5Y клеткаларындагы PGC-1α мРНКсын жана белокту бир кыйла жогорулатат, ал эми пропион кислотасы 12 саат 39 мүнөттө PGC-1α аркылуу музоо гепатоциттериндеги митохондриялык биогенезди күчөтөт. Кызыгы, PGC-1α NRF1 жана TFAMдын түз транскрипциялык жөнгө салуучусу гана эмес, ошондой эле бөлүнүүнү жана биригүүнү жөнгө салуу менен MFN2 жана DRP1 активдүүлүгүн жөнгө салаары көрсөтүлгөн47. Жалпысынан алганда, бул PPA тарабынан индукцияланган митохондриялык компенсатордук жоопторду жөнгө салуучу механизмдердин тыгыз байланышын баса белгилейт. Андан тышкары, биздин маалыматтар PPA стрессинин астында биогенездин жана метаболизмдин транскрипциялык жөнгө салынышынын олуттуу бузулушун чагылдырат.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 жана DRP1 гендери митохондриялык бөлүнүүнүн, биригүүнүн жана динамикасынын борбордук жөнгө салуучуларынын катарына кирет37,48,49. Митохондриялык динамикага катышкан башка көптөгөн гендер бар, бирок STOML2, OPA1 жана MFN2 мурда ASD когорталарында дифференциалдуу метилденгени аныкталган,16 жана бир нече көз карандысыз изилдөөлөр митохондриялык стресске жооп катары бул транскрипция факторлорунун өзгөрүшү жөнүндө кабарлаган50,51.52. OPA1 жана STOML2 экспрессиясы 3 мМ жана 5 мМ PPA менен дарылоо менен бир кыйла төмөндөгөн (3e-сүрөт, f). OPA1 MFN1 жана 2 менен түз өз ара аракеттенүү аркылуу митохондриялык биригүүнүн классикалык жөнгө салуучуларынын бири болуп саналат жана кристалдардын ремоделин түзүүдө жана митохондриялык морфологияда роль ойнойт53. STOML2нин митохондриялык динамикадагы так ролу белгисиз бойдон калууда, бирок далилдер анын митохондриялык биригүүдө, биогенезде жана митофагияда роль ойной тургандыгын көрсөтүп турат.
STOML2 митохондриялык дем алуу байланышын сактоого жана дем алуу чынжырынын комплекстеринин пайда болушуна катышат54,55 жана рак клеткаларынын зат алмашуу мүнөздөмөлөрүн терең өзгөртөөрү көрсөтүлгөн56. Изилдөөлөр көрсөткөндөй, STOML2 BAN жана кардиолипин менен өз ара аракеттенүү аркылуу митохондриялык мембрананын потенциалын жана биогенезин күчөтөт55,57,58. Мындан тышкары, көз карандысыз изилдөөлөр STOML2 менен PINK1дин өз ара аракеттенүүсү митофагияны жөнгө саларын көрсөттү59,60. Белгилей кетчү нерсе, STOML2 MFN2 менен түздөн-түз өз ара аракеттенип, аны турукташтырат жана ошондой эле OPA1 деградациясына жооптуу протеазаны ингибирлөө менен OPA1дин узун изоформаларын турукташтырууда маанилүү ролду ойнойт53,61,62. PPA реакцияларында байкалган STOML2 экспрессиясынын төмөндөшү бул биригүү белокторун убиквитин жана протеасомага көз каранды жолдор аркылуу деградацияга көбүрөөк дуушар кылышы мүмкүн48. STOML2 жана OPA1дин PPAга динамикалык реакциядагы так ролу белгисиз болсо да, бул биригүү гендеринин экспрессиясынын төмөндөшү (3-сүрөт) бөлүнүү менен биригүүнүн ортосундагы тең салмактуулукту бузуп, митохондриянын көлөмүнүн азайышына алып келиши мүмкүн (3-сүрөт). 1).
Башка жагынан алганда, OPA1 белок экспрессиясы 24 сааттан кийин өзгөрүүсүз калган, ал эми MFN1, MFN2 же DRP1 мРНК жана белок деңгээли PPA менен дарылоодон кийин олуттуу өзгөргөн жок (3g-i сүрөт, 4-сүрөт). Бул митохондриялык биригүүгө жана бөлүнүүгө катышкан бул факторлордун жөнгө салынышында эч кандай өзгөрүүлөр жок экенин көрсөтүшү мүмкүн. Бирок, бул төрт гендин ар бири белоктун активдүүлүгүн көзөмөлдөгөн посттранскрипциялык модификациялар (PTM) менен да жөнгө салынаарын белгилей кетүү керек. OPA1де митохондриялык биригүүдө протеолитикалык түрдө бөлүнгөн сегиз альтернативдүү сплайс варианттары бар 63. Узун жана кыска изоформалардын ортосундагы тең салмактуулук акыры OPA1дин митохондриялык биригүүдө жана митохондриялык тармакты сактоодогу ролун аныктайт64. DRP1 активдүүлүгү кальций/кальмодулинге көз каранды протеинкиназа II (CaMKII) фосфорлануусу менен жөнгө салынат, ал эми DRP1 деградациясы убиквитинация жана SUMOйлдануу менен жөнгө салынат65. Акырында, DRP1 жана MFN1/2 экөө тең GTPases болуп саналат, ошондуктан активдүүлүккө митохондриядагы GTP өндүрүшүнүн ылдамдыгы таасир этиши мүмкүн 66. Ошондуктан, бул белоктордун экспрессиясы туруктуу бойдон калса да, бул өзгөрбөгөн белок активдүүлүгүн же локализациясын чагылдырбашы мүмкүн 67,68. Чынында эле, бар болгон PTM белок репертуарлары көбүнчө курч стресстик реакцияларды ортомчулук кылуу үчүн жооптуу биринчи коргонуу линиясы катары кызмат кылат. Биздин моделде орточо зат алмашуу стресси болгондо, PTM митохондриялык бүтүндүктү жетиштүү деңгээлде калыбына келтирүү үчүн биригүү жана бөлүнүү белокторунун активдүүлүгүнүн жогорулашына өбөлгө түзөт, бул гендердин мРНК же белок деңгээлинде кошумча активдешүүсүн талап кылбастан.
Жогорудагы маалыматтар жалпысынан митохондриялык морфологиянын татаал жана убакытка көз каранды жөнгө салынышын жана бул механизмдерди түшүндүрүүдөгү кыйынчылыктарды баса белгилейт. Ген экспрессиясын изилдөө үчүн алгач жолдогу белгилүү бир максаттуу гендерди аныктоо керек. Бирок, биздин маалыматтар бир эле жолдогу гендер бир эле стресске бирдей жооп бербей турганын көрсөтүп турат. Чындыгында, мурунку изилдөөлөр бир эле жолдогу ар кандай гендер ар кандай убакыттык жооп профилдерин көрсөтүшү мүмкүн экенин көрсөткөн30,46. Мындан тышкары, транскрипция менен гендин функциясынын ортосундагы байланышты бузган татаал посттранскрипциялык механизмдер бар. Протеомикалык изилдөөлөр PTM жана белоктун функциясынын таасирин түшүнүүгө мүмкүндүк берет, бирок алар ошондой эле төмөн өткөрүү жөндөмдүүлүгү ыкмалары, жогорку сигнал-ызы-чуу катышы жана начар чечилиш сыяктуу кыйынчылыктарды жаратат.
Бул контекстте, TEM жана MELди колдонуу менен митохондриялык морфологияны изилдөө митохондриялык динамика менен функциянын ортосундагы байланыш жана анын ооруга кандай таасир этери жөнүндөгү фундаменталдык суроолорду чечүү үчүн чоң потенциалга ээ. Эң негизгиси, TEM митохондриялык дисфункциянын жана динамикасынын конвергенттик акыркы чекити катары митохондриялык морфологияны өлчөө үчүн түз ыкманы камсыз кылат51. MEL ошондой эле үч өлчөмдүү клеткалык чөйрөдө бөлүнүү жана биригүү окуяларын визуалдаштыруу үчүн түз ыкманы камсыз кылат, бул ген экспрессиясында өзгөрүүлөр болбогон учурда да динамикалык митохондриялык ремоделдөөнү сандык жактан аныктоого мүмкүндүк берет33. Бул жерде биз митохондриялык сүрөткө тартуу ыкмаларынын экинчилик митохондриялык оорулардагы пайдалуулугун баса белгилейбиз. Бул оорулар, адатта, курч митохондриялык зыяндын ордуна митохондриялык тармактардын тымызын ремоделдөөсү менен мүнөздөлгөн өнөкөт жеңил метаболикалык стресс менен мүнөздөлөт. Бирок, өнөкөт стресстин астында митозду сактоо үчүн талап кылынган митохондриялык компенсация терең функционалдык кесепеттерге алып келет. Нейробиологиянын контекстинде, бул компенсатордук механизмдерди жакшыраак түшүнүү митохондриялык дисфункция менен байланышкан плейотроптук нейропатология жөнүндө маанилүү маалымат бере алат.
Акыр-аягы, биздин маалыматтар нейрондордун митохондриялык динамикасын көзөмөлдөгөн ген экспрессиясынын, белок модификацияларынын жана белок активдүүлүгүнүн ортосундагы татаал өз ара аракеттенүүлөрдүн функционалдык кесепеттерин түшүнүү үчүн сүрөткө тартуу ыкмаларынын пайдалуулугун баса белгилейт. Биз ASDнин митохондриялык компонентин түшүнүү үчүн нейрондук клетка моделиндеги митохондриялык дисфункцияны моделдөө үчүн PPA колдондук. PPA менен дарыланган SH-SY5Y клеткалары митохондриялык морфологияда өзгөрүүлөрдү көрсөттү: митохондриялыктар кичинекей жана тегерек болуп, TEM менен байкалганда кристаллдар начар аныкталган. MEL анализи көрсөткөндөй, бул өзгөрүүлөр жеңил метаболикалык стресске жооп катары митохондриялык тармакты сактоо үчүн бөлүнүү жана биригүү окуяларынын көбөйүшү менен бир убакта пайда болот. Андан тышкары, PPA митохондриялык метаболизмдин жана гомеостаздын транскрипциялык жөнгө салынышын олуттуу түрдө бузат. Биз cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 жана OPA1ди PPA стресси менен бузулган негизги митохондриялык жөнгө салуучу катары аныктадык жана митохондриялык морфологияда жана функцияда PPA тарабынан индукцияланган өзгөрүүлөрдү ортомчулук кылууда роль ойношу мүмкүн. Ген экспрессиясындагы жана белок активдүүлүгүндөгү, локализациядагы жана трансляциядан кийинки модификациялардагы PPA тарабынан индукцияланган убакыттык өзгөрүүлөрдү жакшыраак мүнөздөө үчүн келечектеги изилдөөлөр зарыл. Биздин маалыматтар митохондриялык стресстик реакцияны ортомчулук кылган жөнгө салуучу механизмдердин татаалдыгын жана өз ара байланышын баса белгилейт жана максаттуу механистикалык изилдөөлөр үчүн TEM жана башка сүрөт иштетүү ыкмаларынын пайдалуулугун көрсөтөт.
SH-SY5Y клетка линиясы (ECACC, 94030304-1VL) Sigma-Aldrich компаниясынан сатылып алынган. SH-SY5Y клеткалары Dulbecco компаниясынын модификацияланган Eagle's чөйрөсү/F-12 азык аралашмасында (DMEM/F-12) жана L-глутамин (SC09411, ScienCell) 25 см2 колбаларда 20% түйүлдүк уйдун сывороткасы (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) жана 1% пенициллин-стрептомицин (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) кошулуп, 37 °C, 5% CO2 температурада өстүрүлгөн. Клеткалар 0,05% трипсин-ЭДТА (15400054, ThermoFisher Scientific) колдонуу менен 80% кошулганга чейин субкультураланган, 300 г центрифугаланган жана болжол менен 7 × 105 клетка/мл тыгыздыкта капталган. Бардык эксперименттер 19–22 өтмөктөрдүн ортосундагы дифференциацияланбаган SH-SY5Y клеткаларында жүргүзүлгөн. PPA NaP катары берилет. NaP порошогун (CAS № 137-40-6, химиялык формуласы C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) жылуу MilliQ сууда 1 М концентрациясына чейин эритип, 4°C температурада сактаңыз. Дарылоо күнү бул эритмени 1 М PPA менен 3 мМ жана 5 мМ PPA менен сывороткасыз чөйрөдө (L-глутамин менен DMEM/F-12) суюлтуңуз. Бардык эксперименттер үчүн дарылоо концентрациялары PPA жок (0 мМ, контролдук), 3 мМ жана 5 мМ PPA болгон. Эксперименттер кеминде үч биологиялык кайталоодо жүргүзүлдү.
SH-SY5Y клеткалары 25 см5 колбаларга 5,5 × 105 клетка/мл ылдамдыкта себилип, 24 саат бою өстүрүлдү. PPA менен дарылоо колбага 24 саат инкубациядан мурун кошулду. Клетка гранулдарын сүт эмүүчүлөрдүн ткандарынын кадимки субкультура протоколдоруна ылайык чогултуңуз (жогоруда сүрөттөлгөн). Клетка гранулдарын 100 мкл 2,5% глутаральдегид, 1× PBS эритмесине кайра эритиңиз жана иштетилгенге чейин 4°C температурада сактаңыз. SH-SY5Y клеткалары клеткаларды гранулдоо жана 2,5% глутаральдегид, 1× PBS эритмесин алып салуу үчүн кыска убакытка центрифугаланган. Чөкмөнү дистилденген сууда даярдалган 4% агароза гелине кайра эритиңиз (агарозанын чөкмө көлөмүнө болгон катышы 1:1). Агароза бөлүктөрү жалпак тарелкалардагы торчолорго коюлуп, жогорку басымдагы тоңдуруудан мурун 1-гексадецен менен капталган. Үлгүлөр -90°C температурада 24 саат бою 100% кургак ацетондо тоңдурулган. Андан кийин температура -80°C чейин көтөрүлүп, 1% осмий тетроксидинин жана 0,1% глутаральдегиддин эритмеси кошулган. Үлгүлөр -80°C температурада 24 саат сакталган. Андан кийин, температура бир нече күндүн ичинде акырындык менен бөлмө температурасына чейин көтөрүлгөн: 24 саат бою – 80°Cден – 50°Cге чейин, 24 саат бою – 30°Cге чейин, 24 саат бою – 10°Cге чейин жана акырында бөлмө температурасына чейин.
Криогендик даярдоодон кийин үлгүлөр чайыр менен сиңирилип, Leica Reichert UltracutS ультрамикротомун (Leica Microsystems) колдонуу менен өтө жука кесимдер (∼100 нм) жасалган. Кесимдер 2% уранил ацетаты жана коргошун цитраты менен боёлгон. Үлгүлөр 200 кВ чыңалууда иштеген FEI Tecnai 20 өткөргүч электрондук микроскобу (ThermoFisher (мурдагы FEI), Эйндховен, Нидерланды) (Lab6 өткөргүчү) жана Tridiem энергия чыпкасы менен жабдылган Gatan CCD камерасы (Gatan, Улуу Британия) аркылуу байкалган.
Ар бир техникалык кайталоодо кеминде 24 бир клеткалуу сүрөт алынган, жалпысынан 266 сүрөт. Бардык сүрөттөр Кызыкчылык аймагы (ROI) макросун жана Митохондрия макросун колдонуу менен талданган. Митохондриялык макро жарыяланган ыкмаларга негизделген17,31,32 жана Фиджиде/ImageJ69да TEM сүрөттөрүн жарым-жартылай автоматтык түрдө топтук иштетүүгө мүмкүндүк берет. Кыскача айтканда: сүрөт тоголок шар фонду кемитүү (60 пикселдик радиус) жана FFT тилкелүү өткөргүч чыпкасын (тиешелүүлүгүнө жараша 60 жана 8 пикселдик жогорку жана төмөнкү чектерди колдонуу менен) жана 5% багыттоо толеранттуулугу менен вертикалдык сызыкты басуу аркылуу тескери жана тескери бурулган. Иштетилген сүрөт максималдуу энтропия алгоритмин колдонуу менен автоматтык түрдө босогого коюлат жана экилик маска түзүлөт. Чийки TEM сүрөттөрүндөгү кол менен тандалган ROIлер менен байланышкан сүрөт аймактары алынып, митохондрияны мүнөздөп, плазмалык мембрананы жана башка жогорку контрасттуу аймактарды алып салган. Ар бир алынган ROI үчүн 600 пикселден чоң экилик бөлүкчөлөр талданып, бөлүкчөлөрдүн аянты, периметри, чоң жана кичине октору, Фереттин диаметри, тегеректиги жана тегеректиги Fiji/ImageJдин орнотулган өлчөө функцияларын колдонуу менен өлчөнгөн. Merrill, Flippo жана Strack (2017) боюнча, 2-аянт, бөлүкчөлөрдүн аспект катышы (кичинекей окко болгон чоңдук катышы) жана форма фактору (FF) бул маалыматтардан эсептелген, мында FF = периметр 2/4pi x аянт. Параметрдик формуланын аныктамасын Merrill, Flippo жана Strack (2017) эмгектеринен тапса болот. Айтылган макростор GitHub сайтында жеткиликтүү (Маалыматтардын жеткиликтүүлүгү жөнүндө билдирүүнү караңыз). Орточо эсеп менен, PPA менен дарылоодо болжол менен 5600 бөлүкчө талданып, жалпысынан болжол менен 17000 бөлүкчө болгон (маалыматтар көрсөтүлгөн эмес).
SH-SH5Y клеткалары түнү бою адгезияны сактоо үчүн 8 камералуу өстүрүүчү идиштерге (ThermoFisher, #155411) жайгаштырылып, андан кийин TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) жана Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024) менен инкубацияланган. Сүрөттөр 10 мүнөттүк чөйрөдө 405 нм жана 561 нм лазерлер аркылуу алынган, ал эми чийки сүрөттөр кийинки 12 убакыт чекитинде сүрөт кадрларынын ортосунда 0,2 мкм аз кадамы менен 10 сүрөт микрографиясын камтыган z-стек катары алынган. Сүрөттөр Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 супер чечилиш платформасын (Carl Zeiss, Оберкочен, Германия) LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 линзасын колдонуу менен чогултулган. Сүрөттөр ImageJ программасында мурда сүрөттөлгөн түтүктү жана ImageJ плагинин колдонуп талданып, биригүү жана бөлүнүү окуяларын, митохондриялык түзүлүштөрдүн орточо санын жана клеткадагы орточо митохондриялык көлөмдү өлчөө үчүн жүргүзүлдү33. MEL макростор GitHub сайтында жеткиликтүү (Маалыматтардын жеткиликтүүлүгү жөнүндө билдирүүнү караңыз).
SH-SY5Y клеткалары дарылоодон мурун 24 саат бою алты кудуктуу пластиналарда 0,3 × 106 клетка/мл тыгыздыкта өстүрүлдү. РНК бир аз өзгөртүүлөр менен Quick-RNA™ Miniprep протоколун (ZR R1055, Zymo Research) колдонуу менен бөлүнүп алынды: алып салуудан мурун ар бир кудукка 300 мкл РНК лизис буферин кошуп, ар бир үлгүнү акыркы кадам катары 30 мкл DNase/RNase элюциясы менен лизиске салыңыз. -эркин суу. Бардык үлгүлөр NanoDrop ND-1000 UV-Vis спектрофотометрин колдонуп, саны жана сапаты текшерилди. Клетка лизаттарынан алынган жалпы белок 200 мкл RIPA лизис буферин колдонуу менен алынды, ал эми белоктун концентрациясы Bradford белок анализин колдонуу менен сандык жактан аныкталды70.
кДНК синтези өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык, бир аз өзгөртүүлөр менен Tetro™ кДНК синтез комплектисин (BIO-65043, Meridian Bioscience) колдонуу менен жүргүзүлдү. кДНК 20 мкл реакцияларда жалпы РНКнын 0,7ден 1 мкгге чейин колдонулуп синтезделген. Праймерлер мурда жарыяланган 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (S1 таблицасы) макалаларынан тандалып алынган жана коштоочу зонддор Integrated DNA Technologies компаниясынын PrimerQuest куралын колдонуу менен иштелип чыккан. Кызыкчылык жараткан бардык гендер ядролук B2M генине нормалдаштырылган. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC жана OPA1 ген экспрессиясы RT-qPCR менен өлчөнгөн. Негизги аралашмага LUNA Taq полимеразасы (M3003L, New England Biolabs), 10 мкМ алдыга жана артка праймерлер, кДНК жана ПЦР классындагы суу кирген, бул ар бир реакция үчүн 10 мкл акыркы көлөмдү алуу үчүн жасалган. Бөлүнүү жана бөлүнүү гендеринин экспрессиясы (DRP1, MFN1/2) TaqMan мультиплекстик анализдери аркылуу өлчөнгөн. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык анча чоң эмес өзгөртүүлөр менен колдонулган. Мультиплекстүү RT-qPCR мастер аралашмасы 1X LUNA Taq полимеразасын, 10 мкМ алдыга жана артка праймерлерди, 10 мкМ зондду, кДНКны жана ПЦР классындагы сууну камтыйт, натыйжада ар бир реакция үчүн 20 мкл акыркы көлөм алынган. RT-qPCR Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—сериялык номери: R0618110) аркылуу жүргүзүлдү. Циклдик шарттар S1 таблицасында көрсөтүлгөн. Бардык кДНК үлгүлөрү үч эсе көбөйтүлүп, он эсе суюлтуу сериясын колдонуу менен стандарттык ийри сызык түзүлгөн. Цикл босогосунун стандарттык четтөөсү (Ct) >0,5 болгон үч эселенген үлгүлөрдөгү четтөөлөр маалыматтардын кайталанышын камсыз кылуу үчүн анализден алынып салынган30,72. Салыштырмалуу ген экспрессиясы 2-ΔΔCt79 ыкмасын колдонуу менен эсептелген.
Белок үлгүлөрү (60 мкг) Laemmli жүктөө буфери менен 2:1 катышында аралаштырылып, 12% түссүз белок гелинде (Bio-Rad #1610184) иштетилген. Белоктор Trans-Blot Turbo системасын (#170-4155, Bio-Rad) колдонуу менен PVDF (поливинилиден фториди) мембранасына (#170-84156, Bio-Rad) өткөрүлгөн. Мембрана бөгөттөлүп, тиешелүү баштапкы антителолор (OPA1, MFN1, MFN2 жана DRP1) менен 48 саат бою инкубацияланган (1:1000 суюлтулган), андан кийин экинчилик антителолор (1:10,000) менен 1 саат инкубацияланган. Андан кийин мембраналар Clarity Western ECL субстраты (#170-5061, Bio-Rad) аркылуу сүрөткө тартылып, Bio-Rad ChemiDoc MP системасын колдонуп жазылган. Western blot анализи үчүн ImageLab 6.1 версиясы колдонулган. Баштапкы гель жана дат S1 сүрөттө көрсөтүлгөн. Антителолор жөнүндө маалымат S2 таблицасында берилген.
Маалыматтар топтомдору кеминде үч көз карандысыз үлгүнүн орточо мааниси жана стандарттык катасы (SEM) катары көрсөтүлөт. Маалыматтар топтомдору Гаусс бөлүштүрүлүшүн жана барабар стандарттык четтөөлөрдү кабыл алып, анализдерди улантуудан мурун Шапиро-Уилкс тестин (башкача көрсөтүлбөсө) колдонуу менен нормалдуулукка текшерилген. Маалыматтар топтомун талдоодон тышкары, маанилүүлүктү аныктоо үчүн Фишердин MEL LSD (p < 0,05), бир тараптуу ANOVA (дарылоо жана контролдоо орточо мааниси) жана Даннеттин көптүк салыштыруу тестин (p < 0,05) колдонуу менен жүргүзүлдү. Маанилүү p маанилери графикте *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 катары көрсөтүлгөн. Бардык статистикалык анализдер жана графиктер GraphPad Prism 9.4.0 колдонуу менен аткарылган жана түзүлгөн.
TEM сүрөттөрүн талдоо үчүн Fiji/ImageJ макростор GitHub сайтында жалпыга жеткиликтүү: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Митохондриялык окуяларды аныктоочу (MEL) макросу GitHub сайтында жалпыга жеткиликтүү: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви Н.М. жана Вижая А. Митохондриялар: зат алмашуунун, гомеостаздын, стресстин, картаюунун жана эпигенетиканын башкы жөнгө салуучулары. Индонезиялык. Биомедициналык илим. J. 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Шизофрениядагы көп кырдуу митохондриялык дисфункция, I комплекс мүмкүн болгон патологиялык максат катары. Шизофрения. булак. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. жана Бил, М.Ф. Паркинсон оорусундагы митохондриялык дисфункция. Нейрохимия журналы. 139, 216–231 (2016).
Шарма В.К., Сингх Т.Г. жана Мехта В. Стресске кабылган митохондриялар: Альцгеймер оорусундагы инвазиянын бутасы. Митохондриялар 59, 48–57 (2021).
Беленгуэр П., Дуарте Ж.М.Н., Шук П.Ф. жана Феррейра Г.К. Митохондриялар жана мээ: биоэнергетика жана башкалар. Нейротоксиндер. ресурс. 36, 219–238 (2019).
Рангаражу, В. жана башкалар. Плейотроптук митохондрия: митохондриялардын нейрондордун өнүгүшүнө жана ооруларына тийгизген таасири. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardano-Ramos, C. жана Morais, VA Нейрондордогу митохондриялык биогенез: кантип жана кайда. эл аралык. J. Mor. илим. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендаль, У., Нистер, М. жана Чжао, Дж. Сүт эмүүчүлөрдүн митохондриялык динамикасын жөнгө салуу: мүмкүнчүлүктөр жана кыйынчылыктар. алдыңкы. эндокриндик. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. жана Слэк, РС Нейрогенезди жөнгө салуудагы митохондриялык динамика: өнүгүп келе жаткан мээден чоң кишинин мээсине чейин. өнүгүү. динамикалык. 247, 47–53 (2018).