Макала "Буурчак өсүмдүктөрүнүн оору козгогучтарга жана зыянкечтерге туруктуулугун жогорулатуу" изилдөө темасынын бир бөлүгү болуп саналат, бардык 5 макаланы караңыз.
Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary козу карын оорусунун козгогучу ар кандай кожоюн өсүмдүктөрүн жуктуруу үчүн көп баскычтуу стратегияны колдонот. Бул изилдөөдө Pseudomonas sclerotiorum козгогон ак көккө Phaseolus vulgaris L. молекулярдык, физиологиялык жана биохимиялык реакцияларын күчөтүү үчүн альтернативдүү башкаруу стратегиясы катары башка маанилүү аминокислоталардын синтезин стимулдаштыруучу белок эмес аминокислота диамин L-орнитинди колдонуу сунушталат. In vitro эксперименттери L-орнитин S. pyrenoidosa мицелийинин өсүшүн дозага көз каранды түрдө бир топ басаңдаткандыгын көрсөттү. Андан тышкары, ал күнөскана шарттарында ак көктүн оордугун бир топ төмөндөтө алат. Андан тышкары, L-орнитин иштетилген өсүмдүктөрдүн өсүшүн стимулдашты, бул L-орнитинин сыналган концентрациялары иштетилген өсүмдүктөр үчүн фитотоксикалык эмес экенин көрсөтүп турат. Мындан тышкары, L-орнитин ферменттик эмес антиоксиданттардын (жалпы эрүүчү фенолдор жана флавоноиддер) жана ферменттик антиоксиданттардын (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) жана полифенолоксидаза (PPO)) экспрессиясын күчөтүп, антиоксидантка байланыштуу үч гендин (PvCAT1, PvSOD жана PvGR) экспрессиясын жогорулаткан. Андан тышкары, кремний анализинде S. sclerotiorum геномунда оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) белогунун бар экендиги аныкталган, ал функционалдык анализ, сакталган домендер жана топология жагынан Aspergillus fijiensis (AfOAH) жана Penicillium sp. (PlOAH) оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) белокторуна абдан окшош болгон. Кызыктуусу, картошка декстроза сорпосуна (PDB) L-орнитинди кошуу S. sclerotiorum мицелийиндеги SsOAH генинин экспрессиясын бир топ төмөндөткөн. Ошо сыяктуу эле, L-орнитинди экзогендик колдонуу дарыланган өсүмдүктөрдөн чогултулган козу карын мицелийлеринде SsOAH генинин экспрессиясын бир кыйла төмөндөткөн. Акырында, L-орнитинди колдонуу PDB чөйрөсүндө да, жуккан жалбырактарда да оксал кислотасынын бөлүнүп чыгышын бир кыйла төмөндөткөн. Жыйынтыктап айтканда, L-орнитин кычкылдануу-калыбына келүү абалын сактоодо, ошондой эле жуккан өсүмдүктөрдүн коргонуу реакциясын күчөтүүдө маанилүү ролду ойнойт. Бул изилдөөнүн жыйынтыктары ак көктү көзөмөлдөөнүн инновациялык, экологиялык жактан таза ыкмаларын иштеп чыгууга жана анын буурчак өндүрүшүнө жана башка өсүмдүктөргө тийгизген таасирин азайтууга жардам бериши мүмкүн.
Ак көктүн пайда болушу Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary некротрофиялык козу карынынан келип чыгат жана дүйнөлүк буурчактын (Phaseolus vulgaris L.) өндүрүшүнө олуттуу коркунуч келтирген кыйратуучу, түшүмдүүлүктү төмөндөтүүчү оору болуп саналат (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum - топурак аркылуу жугуучу эң кыйын козу карын өсүмдүктөрүнүн патогендеринин бири, анын кеңири диапазону 600дөн ашык өсүмдүк түрлөрүн камтыйт жана кожоюн ткандарын спецификалык эмес жол менен тез майдалоо жөндөмүнө ээ (Liang and Rollins, 2018). Жагымсыз шарттарда ал өзүнүн жашоо циклинин маанилүү этабынан өтүп, топуракта "склеротия" деп аталган кара, катуу, урук сымал түзүлүштөр же жуккан өсүмдүктөрдүн мицелийинде же сабагынын өзөгүндө ак, мамык өсүндүлөр катары узак убакыт бою уйку абалында калат (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum склеротияны пайда кылууга жөндөмдүү, бул ага жуккан талааларда узак убакыт бою жашоого жана оору учурунда сакталып калууга мүмкүндүк берет (Schwartz et al., 2005). Склеротиялар азык заттарга бай, топуракта узак убакыт бою сакталып, кийинки инфекциялар үчүн негизги инокулум катары кызмат кылат (Schwartz et al., 2005). Ыңгайлуу шарттарда склеротиялар өнүп чыгып, аба аркылуу тараган спораларды пайда кылат, алар өсүмдүктүн бардык жер үстүндөгү бөлүктөрүн, анын ичинде гүлдөрдү, сабактарды же капсулаларды жугуза алат (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum кожоюн өсүмдүктөрүн жуктуруу үчүн көп баскычтуу стратегияны колдонот, ал склеротиалдык өнүп чыгуудан баштап симптомдордун өнүгүшүнө чейинки бир катар координацияланган окуяларды камтыйт. Башында, S. sclerotiorum козу карын сымал түзүлүштөрдөн апотеция деп аталган асма спораларды (аскоспоралар деп аталат) өндүрөт, алар абага тарап, жуккан өсүмдүк калдыктарында кыймылсыз склеротияга айланат (Bolton et al., 2006). Андан кийин козу карын өсүмдүктүн клетка дубалынын рН деңгээлин көзөмөлдөө, ферменттик деградацияны жана ткандардын инвазиясын күчөтүү (Hegedus and Rimmer, 2005) жана кожоюн өсүмдүктүн кычкылдануу жарылуусун басуу үчүн вируленттүүлүк фактору болгон оксал кислотасын бөлүп чыгарат. Бул кычкылдануу процесси өсүмдүктүн клетка дубалын алсыратат, козу карындын клетка дубалын деградациялоочу ферменттердин (CWDE) кадимки жана натыйжалуу иштеши үчүн жагымдуу чөйрөнү камсыз кылат, бул патогендин физикалык тоскоолдукту жеңип, кожоюн ткандарына кирүүсүнө мүмкүндүк берет (Marciano et al., 1983). S. sclerotiorum сиңип кеткенден кийин, полигалактуроназа жана целлюлаза сыяктуу бир катар CWDE бөлүп чыгарат, алар анын инфекцияланган ткандарда жайылышына өбөлгө түзөт жана ткандардын некрозуна алып келет. Жаракаттардын жана гифалдык төшөктөрдүн өнүгүшү ак көктүн мүнөздүү белгилерине алып келет (Hegedus жана Rimmer, 2005). Ошол эле учурда, кожоюн өсүмдүктөрү патоген менен байланышкан молекулярдык үлгүлөрдү (PAMP) үлгү таануу рецепторлору (PRRs) аркылуу таанып, акырында коргонуу реакцияларын активдештирүүчү бир катар сигналдык окуяларды козгойт.
Ооруларды көзөмөлдөө боюнча ондогон жылдар бою жүргүзүлгөн аракеттерине карабастан, башка коммерциялык өсүмдүктөрдөгүдөй эле, буурчакта да патогендин туруктуулугу, жашоого жөндөмдүүлүгү жана адаптацияланышынан улам жетиштүү туруктуу гермоплазманын жетишсиздиги сакталып калууда. Ошондуктан, ооруларды башкаруу өтө татаал жана маданий тажрыйбалардын, биологиялык көзөмөлдүн жана химиялык фунгициддердин айкалышын камтыган комплекстүү, көп кырдуу стратегияны талап кылат (O'Sullivan et al., 2021). Ак көктүн химиялык көзөмөлү эң натыйжалуу, анткени фунгициддер туура жана өз убагында колдонулганда, оорунун жайылышын натыйжалуу көзөмөлдөп, инфекциянын оордугун азайтып, түшүмдүүлүктүн жоготууларын азайта алат. Бирок, фунгициддерди ашыкча колдонуу жана аларга ашыкча таянуу S. sclerotiorumдун туруктуу штаммдарынын пайда болушуна алып келип, максаттуу эмес организмдерге, топурактын ден соолугуна жана суунун сапатына терс таасирин тийгизиши мүмкүн (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Ошондуктан, экологиялык жактан таза альтернативаларды табуу эң башкы артыкчылыкка айланды.
Путресцин, спермидин, спермин жана кадаврин сыяктуу полиаминдер (ПА) топурак аркылуу жугуучу өсүмдүк патогендерине каршы келечектүү альтернатива катары кызмат кыла алат, ошону менен кооптуу химиялык фунгициддерди колдонууну толугу менен же жарым-жартылай азайтат (Нехела жана башкалар, 2024; Йи жана башкалар, 2024). Жогорку өсүмдүктөрдө ПА көптөгөн физиологиялык процесстерге катышат, анын ичинде клеткалардын бөлүнүшү, дифференциациясы жана абиотикалык жана биотикалык стресстерге жооп кайтаруу (Киллини жана Нехела, 2020). Алар антиоксиданттар катары иштей алышат, реактивдүү кычкылтек түрлөрүн (ROS) тазалоого жардам берет, кычкылтектин редокс гомеостазын сактай алышат (Nehela жана Killiny, 2023), коргонууга байланыштуу гендерди индукциялай алышат (Romero et al., 2018), ар кандай зат алмашуу жолдорун жөнгө салат (Nehela жана Killiny, 2023), эндогендик фитогормондорду модуляциялай алышат (Nehela жана Killiny, 2019), системалуу алынган туруктуулукту (SAR) орното алышат жана өсүмдүк-патоген өз ара аракеттенүүсүн жөнгө сала алышат (Nehela жана Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Өсүмдүктөрдү коргоодогу ПАнын өзгөчө механизмдери жана ролу өсүмдүк түрлөрүнө, патогендерге жана айлана-чөйрөнүн шарттарына жараша өзгөрүп тураарын белгилей кетүү керек. Өсүмдүктөрдөгү эң көп кездешкен ПА маанилүү полиамин L-орнитинден биосинтезделет (Killiny and Nehela, 2020).
L-орнитин өсүмдүктөрдүн өсүшүндө жана өнүгүшүндө бир нече ролду ойнойт. Мисалы, мурунку изилдөөлөр күрүчтө (Oryza sativa) орнитин азотту кайра иштетүү (Liu et al., 2018), күрүчтүн түшүмдүүлүгү, сапаты жана жыты (Lu et al., 2020) жана суунун стрессине жооп кайтаруу (Yang et al., 2000) менен байланыштуу болушу мүмкүн экенин көрсөткөн. Андан тышкары, L-орнитинди экзогендик колдонуу кант кызылчасында (Beta vulgaris) кургакчылыкка чыдамдуулукту бир кыйла жогорулатты (Hussein et al., 2019) жана пиязда (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu жана Çavuşoǧlu, 2021) жана кешью (Anacardium occidentale) өсүмдүктөрүндө туз стрессин азайтты (da Rocha et al., 2012). L-орнитиндин абиотикалык стресстен коргонуудагы потенциалдуу ролу анын иштетилген өсүмдүктөрдө пролиндин топтолушуна катышуусуна байланыштуу болушу мүмкүн. Мисалы, пролин метаболизмине байланыштуу гендер, мисалы, орнитин дельта аминотрансфераза (дельта-OAT) жана пролиндегидрогеназа (ProDH1 жана ProDH2) гендери, мурда Nicotiana benthamiana жана Arabidopsis thalianaны кожоюн эмес Pseudomonas syringae штаммдарынан коргоого катышаары кабарланган (Senthil-Kumar жана Mysore, 2012). Башка жагынан алганда, козу карындын орнитин декарбоксилазасы (ODC) патогендин өсүшү үчүн талап кылынат (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ODCсин кожоюн тарабынан индукцияланган генди басуу (HIGS) аркылуу бутага алуу помидор өсүмдүктөрүнүн Fusarium солууга туруктуулугун бир топ жогорулатты (Singh et al., 2020). Бирок, экзогендик орнитинди фитопатоген сыяктуу биотикалык стресстерге каршы колдонуунун потенциалдуу ролу жакшы изилдене элек. Андан да маанилүүсү, орнитиндин ооруларга туруктуулукка тийгизген таасири жана ага байланыштуу биохимиялык жана физиологиялык кубулуштар азырынча толук изилдене элек.
Буурчак өсүмдүктөрүнүн S. sclerotiorum инфекциясынын татаалдыгын түшүнүү натыйжалуу күрөшүү стратегияларын иштеп чыгуу үчүн маанилүү. Бул изилдөөдө биз диамин L-орнитининин коргонуу механизмдерин жана буурчак өсүмдүктөрүнүн Sclerotinia sclerotiorum инфекциясына туруктуулугун жогорулатуудагы негизги фактор катары потенциалдуу ролун аныктоону максат кылдык. Биз инфекцияланган өсүмдүктөрдүн коргонуу реакцияларын күчөтүүдөн тышкары, L-орнитин кычкылдануу-калыбына келүү абалын сактоодо да маанилүү ролду ойнойт деп божомолдойбуз. Биз L-орнитинин потенциалдуу таасири ферменттик жана ферменттик эмес антиоксиданттык коргонуу механизмдерин жөнгө салуу жана грибоктук патогендүүлүк/вируленттүүлүк факторлоруна жана ага байланыштуу белокторго кийлигишүү менен байланыштуу деп божомолдойбуз. L-орнитинин бул кош функциялуулугу аны ак көктүн таасирин азайтуу жана кеңири таралган буурчак өсүмдүктөрүнүн бул күчтүү грибоктук патогенге туруктуулугун жогорулатуу боюнча туруктуу стратегия үчүн келечектүү талапкер кылат. Бул изилдөөнүн жыйынтыктары ак көктү көзөмөлдөөнүн инновациялык, экологиялык жактан таза ыкмаларын иштеп чыгууга жана анын буурчак өндүрүшүнө тийгизген таасирин азайтууга жардам бериши мүмкүн.
Бул изилдөөдө тажрыйбалык материал катары кадимки буурчактын сезгич коммерциялык сорту Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) колдонулган. Дени сак үрөндөр Египеттин Айыл чарба изилдөө борборунун (ARC) Талаа өсүмдүктөрүн изилдөө институтунун (FCRI) буурчак өсүмдүктөрүн изилдөө бөлүмү тарабынан берилген. Беш үрөн күнөскана шарттарында (25 ± 2 °C, салыштырмалуу нымдуулук 75 ± 1%, 8 саат жарык/16 саат караңгы) S. sclerotiorum менен жуккан топурак менен толтурулган пластик идиштерге (ички диаметри 35 см, тереңдиги 50 см) себилген. Себилгенден кийин 7–10 күндөн кийин (DPS) көчөттөр суюлтулуп, ар бир идиште бирдей өскөн эки гана көчөт жана үч толук кеңейген жалбырак калтырылган. Бардык идиш өсүмдүктөрү эки жумада бир жолу сугарылып, берилген сорт үчүн сунушталган өлчөмдө ай сайын жер семирткичтер чачылган.
500 мг/л концентрациядагы L-орнитиндиаминди (ошондой эле (+)-(S)-2,5-диаминопентан кислотасы деп да аталат; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) даярдоо үчүн 50 мг алгач 100 мл стерилденген дистилденген сууда эритилген. Андан кийин баштапкы эритме суюлтулуп, кийинки эксперименттерде колдонулган. Кыскача айтканда, L-орнитин концентрацияларынын алты сериясы (12,5, 25, 50, 75, 100 жана 125 мг/л) in vitro шартында текшерилген. Мындан тышкары, терс контролдук (Mock) катары стерилденген дистилденген суу жана оң контролдук катары коммерциялык фунгицид "Rizolex-T" 50% нымдалуучу порошок (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Гарбия губернаторлугу, Египет) колдонулган. Коммерциялык фунгицид "Rizolex-T" беш концентрацияда (2, 4, 6, 8 жана 10 мг/л) in vitro шартында сыналган.
Ак көктүн типтүү симптомдорун көрсөткөн кадимки буурчак сабактарынын жана кабыктарынын үлгүлөрү (инфекциянын деңгээли: 10–30%) коммерциялык чарбалардан чогултулган. Инфекцияланган өсүмдүк материалдарынын көпчүлүгү түр/сорт боюнча аныкталганы менен (сезгич коммерциялык сорт Giza 3), башкалары, айрыкча жергиликтүү базарлардан алынгандары белгисиз түрлөргө таандык болгон. Чогултулган инфекцияланган материалдар алгач 0,5% натрий гипохлорит эритмеси менен 3 мүнөт бою бети дезинфекцияланган, андан кийин стерилденген дистилденген суу менен бир нече жолу чайкалып, ашыкча сууну кетирүү үчүн стерилденген чыпка кагазы менен кургатылган. Андан кийин инфекцияланган органдар ортоңку ткандан (дени сак жана инфекцияланган ткандардын ортосунда) кичинекей бөлүктөргө кесилип, картошка декстроза агарында (PDA) өстүрүлүп, склеротиянын пайда болушун стимулдаштыруу үчүн 25 ± 2 °C температурада 12 саат жарык/12 саат караңгы цикл менен 5 күн инкубацияланган. Мицелий уч ыкмасы аралаш же булганган культуралардан грибоктук изоляттарды тазалоо үчүн да колдонулган. Тазаланган грибоктук изолят алгач анын маданий морфологиялык мүнөздөмөлөрүнүн негизинде аныкталып, андан кийин микроскопиялык өзгөчөлүктөргө таянып, S. sclerotiorum экени тастыкталды. Акырында, бардык тазаланган изоляттар Кох постулаттарына жооп берүү үчүн сезгич Giza 3 кадимки буурчак сортунда патогендүүлүккө текшерилди.
Мындан тышкары, эң инвазивдүү S. sclerotiorum изоляты (изолят №3) White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017 тарабынан сүрөттөлгөндөй, ички транскрипцияланган спейсер (ITS) секвенирлөөнүн негизинде андан ары тастыкталган. Кыскача айтканда, изоляттар картошка декстроза сорпосунда (PDB) өстүрүлүп, 25 ± 2 °C температурада 5–7 күн инкубацияланган. Андан кийин грибок мицелийи чогултулуп, марля аркылуу чыпкаланып, эки жолу стерилдүү суу менен жуулуп, стерилдүү чыпка кагазы менен кургатылган. Геномдук ДНК Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) аркылуу бөлүнүп алынган. Андан кийин ITS рДНК аймагы белгилүү бир праймер жубу ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATGC; күтүлгөн өлчөмү: 540 б.п.) аркылуу күчөтүлгөн (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Тазаланган ПЦР продуктулары секвенирлөөгө берилген (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS рДНК ырааттуулуктары Sanger секвенирлөө ыкмасын колдонуу менен эки багыттуу секвенирленген. Андан кийин чогултулган суроо ырааттуулуктары BLASTn программасын колдонуу менен GenBank жана Улуттук биотехнологиялык маалымат борборунун (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) акыркы маалыматтары менен салыштырылган. Суроо ырааттуулугу NCBI GenBank'тагы (S1 кошумча таблицасы) акыркы маалыматтардан алынган башка 20 S. sclerotiorum штаммдары/изоляттары менен Молекулярдык эволюциялык генетика анализ пакетиндеги (MEGA-11; 11-версия) ClustalW колдонуу менен салыштырылган (Kumar et al., 2024). Эволюциялык анализ максималдуу ыктымалдуулук ыкмасын жана жалпы убакыт боюнча кайтарылуучу нуклеотиддик алмаштыруу моделин колдонуу менен жүргүзүлдү (Nei and Kumar, 2000). Эң жогорку логарифмдик ыктымалдуулукка ээ болгон дарак көрсөтүлгөн. Эвристикалык издөө үчүн баштапкы дарак коңшулаш кошулуучу (NJ) дарак (Kumar et al., 2024) менен максималдуу парсимония (MP) дарагынын ортосундагы логарифмдик ыктымалдуулук жогору болгон даракты тандоо менен тандалат. NJ дарагы жалпы убакыт боюнча кайтарылуучу моделди колдонуу менен эсептелген жуп аралык матрицасын колдонуу менен курулган (Nei and Kumar, 2000).
L-орнитиндин жана "Rizolex-T" бактерицидинин антибактериалдык активдүүлүгү in vitro шартында агар диффузиялык ыкмасы менен аныкталган. Ыкмасы: L-орнитиндин запастык эритмесинин тиешелүү өлчөмүн (500 мг/л) алып, аны 10 мл PDA азыктандыруучу чөйрөсү менен жакшылап аралаштырып, тиешелүүлүгүнө жараша 12,5, 25, 50, 75, 100 жана 125 мг/л акыркы концентрациядагы эритмелерди даярдаңыз. Контролдук катары "Rizolex-T" фунгицидинин беш концентрациясы (2, 4, 6, 8 жана 10 мг/л) жана стерилденген дистилденген суу колдонулган. Чөйрө катып калгандан кийин, диаметри 4 мм болгон Sclerotinia sclerotiorum культурасынын жаңы даярдалган мицелий тыгыны Петри чөйчөгүнүн ортосуна которулуп, мицелий контролдук Петри чөйчөгүн толугу менен каптаганга чейин 25±2°C температурада өстүрүлгөн, андан кийин грибоктун өсүшү катталган. 1-теңдемени колдонуп, S. sclerotiorumдун радиалдык өсүшүнүн пайыздык ингибирлөөсүн эсептегиле:
Эксперимент эки жолу кайталанды, ар бир контролдук/эксперименталдык топ үчүн алты биологиялык кайталоо жана ар бир биологиялык кайталоо үчүн беш идиш (ар бир идишке эки өсүмдүк) колдонулду. Эксперименттик жыйынтыктардын тактыгын, ишенимдүүлүгүн жана кайталанышын камсыз кылуу үчүн ар бир биологиялык кайталоо эки жолу (эки техникалык кайталоо) талданды. Мындан тышкары, жарым максималдуу ингибирлөөчү концентрацияны (IC50) жана IC99ду эсептөө үчүн пробит регрессиялык анализи колдонулган (Prentice, 1976).
Күнөскана шарттарында L-орнитиндин потенциалын баалоо үчүн эки удаалаш идиш эксперименттери жүргүзүлдү. Кыскача айтканда, идиштер стерилденген чопо-кум топурак менен толтурулуп (3:1), жаңы даярдалган S. sclerotiorum культурасы менен эмделген. Алгач, S. sclerotiorumдун эң инвазивдүү изоляты (3-изолят) бир склеротийди экиге бөлүп, бети менен PDAга коюп, мицелиалдык өсүштү стимулдаштыруу үчүн 25°C температурада 4 күн бою караңгылыкта (24 саат) инкубациялоо жолу менен өстүрүлгөн. Андан кийин алдыңкы четинен 5 мм диаметрдеги төрт агар тыгыны алынып, ага 100 г буудай жана күрүч кебегинин стерилденген аралашмасы (1:1, v/v) менен эмделген жана бардык колбалар склеротийдин пайда болушун стимулдаштыруу үчүн 25 ± 2°C температурада 5 күн бою 12 саат жарык/12 саат караңгы цикл астында инкубацияланган. Топурак кошуудан мурун бир тектүүлүктү камсыз кылуу үчүн бардык колбалардын курамы жакшылап аралаштырылган. Андан кийин, патогендердин туруктуу концентрациясын камсыз кылуу үчүн ар бир идишке 100 г колонизациялоочу кебек аралашмасы кошулган. Эмделген идиштер козу карындардын өсүшүн активдештирүү үчүн сугарылып, 7 күн бою күнөскана шартында жайгаштырылган.
Андан кийин ар бир идишке Giza 3 сортундагы беш үрөн себилген. L-орнитин жана Rizolex-T фунгициди менен иштетилген идиштер үчүн стерилденген үрөндөр алгач эки кошулманын суу эритмесине эки саат бою IC99 концентрациясы тиешелүүлүгүнө жараша 250 мг/л жана 50 мг/л болгон акыркы концентрациясы менен чыланган, андан кийин себүүдөн бир саат мурун абада кургатылган. Башка жагынан алганда, үрөндөр терс контрол катары стерилденген дистилденген сууга чыланган. 10 күндөн кийин, биринчи сугаруунун алдында, көчөттөр суюлтулуп, ар бир идиште эки гана тыкан көчөт калган. Мындан тышкары, S. sclerotiorum менен инфекцияны камсыз кылуу үчүн, бирдей өнүгүү стадиясындагы (10 күн) буурчак өсүмдүгүнүн сабактары стерилденген скальпель менен эки башка жерден кесилип, ар бир жараатка болжол менен 0,5 г колонизациялоочу кебек аралашмасы салынган, андан кийин бардык эмделген өсүмдүктөрдө инфекцияны жана оорунун өнүгүшүн стимулдаштыруу үчүн жогорку нымдуулук колдонулган. Контролдук өсүмдүктөр да ушундай эле жаракат алган жана оорунун өнүгүшү үчүн чөйрөнү симуляциялоо жана дарылоо топторунун ортосундагы ырааттуулукту камсыз кылуу максатында жараатка бирдей өлчөмдө (0,5 г) стерилденген, колониялашпаган кебек аралашмасы салынып, жогорку нымдуулукта кармалган.
Дарылоо ыкмасы: Буурчак көчөттөрү топуракты сугаруу менен 500 мл L-орнитиндин суу эритмеси (250 мг/л) же Rizolex-T фунгициди (50 мг/л) менен сугарылган, андан кийин дарылоо 10 күндүк аралык менен үч жолу кайталанган. Плацебо менен дарыланган контролдук өсүмдүктөр 500 мл стерилденген дистилденген суу менен сугарылган. Бардык дарылоо күнөскана шарттарында (25 ± 2°C, 75 ± 1% салыштырмалуу нымдуулук жана 8 саат жарык/16 саат караңгы фотопериод) жүргүзүлгөн. Бардык идиштер эки жумада бир жолу сугарылып, ай сайын тең салмактуу NPK жер семирткичи (20-20-20, 3,6% күкүрт жана TE микроэлементтери менен; Zain Seeds, Египет) менен 3-4 г/л концентрациясында белгилүү бир сорт үчүн сунуштарга жана өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык жалбырактарга чачуу менен иштетилген. Эгерде башкача көрсөтүлбөсө, ар бир биологиялык көчүрмөдөн толугу менен кеңейтилген жетилген жалбырактар ​​(үстү жагынан 2- жана 3-жалбырактар) дарылоодон кийин 72 сааттан кийин (hpt) чогултулуп, гомогендештирилип, бириктирилип, -80 °C температурада андан аркы анализдер үчүн сакталган, анын ичинде, бирок алар менен чектелбестен, кычкылдануу стрессинин индикаторлорунун гистохимиялык локализациясын, липиддик пероксидацияны, ферменттик жана ферменттик эмес антиоксиданттарды жана ген экспрессиясын аныктоо.
Ак көктүн инфекциясынын интенсивдүүлүгү эмдөөдөн 21 күн өткөндөн кийин жума сайын (dpi) 1–9 шкаласы (S2 кошумча таблицасы) колдонулуп бааланган, ал Теран жана башкалар тарабынан өзгөртүлгөн Петцольдт жана Диксон шкаласы (1996) боюнча жүргүзүлгөн (2006). Кыскача айтканда, буурчак өсүмдүктөрүнүн сабактары жана бутактары эмдөө жеринен баштап, жабыркоолордун түйүндөр аралык жана түйүндөр боюнча өнүгүшүн көзөмөлдөө үчүн изилденген. Андан кийин жабыркоонун эмдөө жеринен сабактын же бутактын боюнча эң алыскы чекитине чейинки аралыгы өлчөнгөн жана жабыркоонун жайгашкан жерине жараша 1–9 балл берилген, мында (1) эмдөө жеринин жанында көрүнгөн инфекция жок экенин жана (2–9) жабыркоонун өлчөмүнүн акырындык менен көбөйгөнүн жана түйүндөр/түйүндөр аралык өнүгүшүн көрсөткөн (S2 кошумча таблицасы). Андан кийин ак көктүн инфекциясынын интенсивдүүлүгү 2-формуланы колдонуп пайызга айландырылган:
Мындан тышкары, оорунун өнүгүшүнүн ийри сызыгынын астындагы аянт (AUDPC) жакында эле кадимки буурчактын ак чириги үчүн ылайыкташтырылган формула (Shaner and Finney, 1977) аркылуу эсептелген (Chauhan et al., 2020): 3-теңдемени колдонуу менен:
Мында Yi = ti убакытындагы оорунун оордугу, Yi+1 = кийинки убакыттагы оорунун оордугу ti+1, ti = биринчи өлчөө убактысы (күндөр менен), ti+1 = кийинки өлчөө убактысы (күндөр менен), n = убакыт чекиттеринин же байкоо чекиттеринин жалпы саны. Өсүмдүктүн бийиктиги (см), бир өсүмдүктөгү бутактардын саны жана бир өсүмдүктөгү жалбырактардын саны сыяктуу буурчак өсүмдүгүнүн өсүү параметрлери бардык биологиялык кайталоолордо 21 күн бою жума сайын жазылып турган.
Ар бир биологиялык кайталоонун жалбырак үлгүлөрү (жогорку жагынан экинчи жана үчүнчү толук өнүккөн жалбырактар) дарылоодон кийинки 45-күнү (акыркы дарылоодон 15 күн өткөндөн кийин) чогултулган. Ар бир биологиялык кайталоонун курамында беш идиш бар (ар бир идиште эки өсүмдүк бар). Майдаланган ткандын болжол менен 500 мг бөлүгү караңгыда 4°C температурада 80% ацетонду колдонуп, фотосинтетикалык пигменттерди (хлорофилл а, хлорофилл b жана каротиноиддер) экстракциялоо үчүн колдонулган. 24 сааттан кийин үлгүлөр центрифугаланып, үстүнкү катмар үч башка толкун узундугундагы (A470, A646 жана A663 нм) абсорбцияны өлчөө менен (Lichtenthaler, 1987) ыкмасы боюнча UV-160A спектрофотометрин (Shimadzu Corporation, Япония) колдонуп, колориметриялык түрдө хлорофилл а, хлорофилл b жана каротиноиддердин курамын аныктоо үчүн чогултулган. Акырында, фотосинтетикалык пигменттердин курамы Lichtenthaler (1987) тарабынан сүрөттөлгөн төмөнкү 4–6 формулаларды колдонуу менен эсептелген.
Дарылоодон кийин 72 сааттан кийин (hpt), суутек перекисинин (H2O2) жана супероксид анионунун (O2•−) in situ гистохимиялык локализациясы үчүн ар бир биологиялык көчүрмөдөн жалбырактар ​​(үстү жагынан экинчи жана үчүнчү толук өнүккөн жалбырактар) чогултулган. Ар бир биологиялык көчүрмө беш идиштен турган (ар бир идишке эки өсүмдүк). Ыкманын тактыгын, ишенимдүүлүгүн жана кайталанышын камсыз кылуу үчүн ар бир биологиялык көчүрмө эки нускада (эки техникалык көчүрмө) талданган. H2O2 жана O2•− тиешелүүлүгүнө жараша 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) же нитрокөк тетразолий (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) колдонулуп, Ромеро-Пуэртас жана башкалар (2004) жана Адам жана башкалар (1989) тарабынан сүрөттөлгөн ыкмаларды бир аз өзгөртүүлөр менен аткарышкан. H2O2 гистохимиялык локализациясын in situ үчүн баракчалар 10 мМ Tris буферинде (рН 7.8) 0.1% DAB менен вакуумда инфильтрацияланып, андан кийин бөлмө температурасында жарыкта 60 мүнөт инкубацияланган. Баракчалар 4:1 (к/к) этанол:хлороформдо (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) 0.15% (к/к) TCAда агартылып, андан кийин караңгыланганга чейин жарыкка коюлган. Ошо сыяктуу эле, клапандар O2•− гистохимиялык локализациясын in situ үчүн 0.1 w/v % HBT камтыган 10 мМ калий фосфаты буфери (рН 7.8) менен вакуумда инфильтрацияланган. Баракчалар бөлмө температурасында жарыкта 20 мүнөт инкубацияланган, андан кийин жогорудагыдай агартылган, андан кийин кочкул көк/кызгылт көк тактар ​​пайда болгонго чейин жарыктандырылган. Натыйжада күрөң (H2O2 индикатору катары) же көк-кызгылт көк (O2•− индикатору катары) түстүн интенсивдүүлүгү ImageJ сүрөт иштетүү пакетинин Фиджи версиясын колдонуу менен бааланган (http://fiji.sc; 2024-жылдын 7-мартында кирген).
Малондиальдегид (MDA; липиддик пероксидациянын маркери катары) Дю жана Брамладж (1992) ыкмасы боюнча бир аз өзгөртүүлөр менен аныкталган. Ар бир биологиялык көчүрмөнүн жалбырактары (үстү жагынан экинчи жана үчүнчү толук өнүккөн жалбырактар) дарылоодон 72 саат өткөндөн кийин (hpt) чогултулган. Ар бир биологиялык көчүрмөгө беш идиш (ар бир идишке экиден өсүмдүк) кирген. Ар бир биологиялык көчүрмө ыкманын тактыгын, ишенимдүүлүгүн жана кайталанышын камсыз кылуу үчүн эки жолу (эки техникалык көчүрмө) талданган. Кыскача айтканда, MDA экстракциясы үчүн 0,5 г майдаланган жалбырак тканы 0,01% бутилденген гидрокситолуолду (BHT; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) камтыган 20% трихлорацетат кислотасы (TCA; MilliporeSigma, Берлингтон, MA, АКШ) менен колдонулган. Андан кийин үстүнкү катмардагы MDAнын курамы UV-160A спектрофотометрин (Shimadzu Corporation, Япония) колдонуу менен 532 жана 600 нм толкун узундугундагы абсорбцияны өлчөө менен колориметриялык түрдө аныкталып, андан кийин нмоль g−1 FW катары көрсөтүлгөн.
Ферменттик эмес жана ферменттик антиоксиданттарды баалоо үчүн, ар бир биологиялык көчүрмөдөн дарылоодон кийин 72 сааттан кийин (hpt) жалбырактар ​​(жогорку жагынан экинчи жана үчүнчү толук өнүккөн жалбырактар) чогултулган. Ар бир биологиялык көчүрмө беш идиштен турган (ар бир идишке экиден өсүмдүк). Ар бир биологиялык үлгү эки нускада талданган (эки техникалык үлгү). Эки жалбырак суюк азот менен майдаланып, ферменттик жана ферменттик эмес антиоксиданттарды, жалпы аминокислоталарды, пролиндин курамын, гендин экспрессиясын жана оксалаттын сандык көрсөткүчүн аныктоо үчүн түздөн-түз колдонулган.
Жалпы эрүүчү фенолдор Кахконен жана башкалар (1999) тарабынан сүрөттөлгөн ыкманын бир аз өзгөртүүлөрү менен Фолин-Чиокалтеу реагентин (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) колдонуу менен аныкталган. Кыскача айтканда, болжол менен 0,1 г гомогендештирилген жалбырак тканы 20 мл 80% метанол менен караңгыда 24 саат бою экстракцияланган жана үстүнкү катмар центрифугалоодон кийин чогултулган. Үлгү экстрактынын 0,1 мли 0,5 мл Фолин-Чиокалтеу реагенти (10%) менен аралаштырылган, 30 секунд чайкалып, караңгыда 5 мүнөткө калтырылган. Андан кийин ар бир пробиркага 0,5 мл 20% натрий карбонатынын эритмеси (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каир, Египет) кошулуп, жакшылап аралаштырылып, бөлмө температурасында караңгыда 1 саат инкубацияланган. Инкубациядан кийин реакция аралашмасынын абсорбциясы 765 нм толкун узундугунда UV-160A спектрофотометри (Shimadzu Corporation, Япония) аркылуу өлчөнгөн. Үлгү экстракттарындагы жалпы эрүүчү фенолдордун концентрациясы галл кислотасын калибрлөө ийри сызыгын (Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, АКШ) колдонуу менен аныкталган жана жаңы салмактын бир граммына галл кислотасынын эквивалентинин миллиграммы катары көрсөтүлгөн (мг GAE g-1 жаңы салмак).
Жалпы эрүүчү флавоноиддердин курамы Джеридан ж.б. (2006) ыкмасы боюнча бир аз өзгөртүүлөр менен аныкталган. Кыскача айтканда, жогорудагы метанол экстрактынын 0,3 мл 5% алюминий хлоридинин эритмеси (AlCl3; Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмптон, АКШ) менен аралаштырылып, катуу аралаштырылып, андан кийин бөлмө температурасында 5 мүнөт инкубацияланган, андан кийин 0,3 мл 10% калий ацетатынын эритмеси (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) кошулуп, жакшылап аралаштырылып, бөлмө температурасында 30 мүнөт караңгыда инкубацияланган. Инкубациядан кийин, реакция аралашмасынын абсорбциясы 430 нмде UV-160A спектрофотометри (Shimadzu Corporation, Япония) аркылуу өлчөнгөн. Үлгү экстракттарындагы жалпы эрүүчү флавоноиддердин концентрациясы рутинди калибрлөө ийри сызыгы (TCI America, Портленд, Орегон, АКШ) аркылуу аныкталган, андан кийин жаңы салмактагы бир граммга рутин эквивалентинин миллиграммы катары көрсөтүлгөн (мг RE г-1 жаңы салмак).
Буурчак жалбырактарынын жалпы эркин аминокислота курамы Йокояма жана Хираматсу (2003) тарабынан сунушталган жана Сан жана башкалар (2006) тарабынан модификацияланган ыкманын негизинде модификацияланган нингидрин реагенти (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, АКШ) аркылуу аныкталган. Кыскача айтканда, 0,1 г майдаланган ткань рН 5,4 буфери менен экстракцияланган жана 200 мкл үстүнкү катмар 200 мкл нингидрин (2%) жана 200 мкл пиридин (10%; Spectrum Chemical, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, АКШ) менен реакцияга киргизилген, кайнак суу мончосунда 30 мүнөт инкубацияланган, андан кийин муздатылган жана UV-160A спектрофотометри (Shimadzu Corporation, Япония) аркылуу 580 нмде өлчөнгөн. Башка жагынан алганда, пролин Бейтс ыкмасы менен аныкталган (Бейтс жана башкалар, 1973). Пролин 3% сульфосалицил кислотасы менен экстракцияланган (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, MA, АКШ) жана центрифугалоодон кийин үстүнкү катмардын 0,5 мли 1 мл муз уксус кислотасы (Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, АКШ) жана нингидрин реагенти менен аралаштырылган, 90°C температурада 45 мүнөт инкубацияланган, муздатылган жана жогорудагыдай эле спектрофотометрди колдонуп 520 нм толкун узундугунда өлчөнгөн. Жалбырак экстракттарындагы жалпы эркин аминокислоталар жана пролин тиешелүүлүгүнө жараша глицин жана пролинди калибрлөө ийри сызыктары (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, АКШ) аркылуу аныкталган жана мг/г жаңы салмак катары көрсөтүлгөн.
Антиоксидант ферменттердин ферменттик активдүүлүгүн аныктоо үчүн, болжол менен 500 мг гомогендештирилген ткандар 1 мМ EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) жана 7,5% поливинилпирролидон (PVP; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, АКШ) камтыган 3 мл 50 мМ Tris буфери (рН 7,8) менен экстракцияланып, муздаткычта (4°C) 20 мүнөт 10 000 × g ылдамдыкта центрифугаланган жана үстүнкү катмар (чийки фермент экстракты) чогултулган (Эль-Нагар жана башкалар, 2023; Осман жана башкалар, 2023). Андан кийин каталаза (CAT) 2 мл 0,1 М натрий фосфаты буфери (рН 6,5; Сигма-Олдрич, Сент-Луис, Миссури, АКШ) жана 100 мкл 269 мМ H2O2 эритмеси менен реакцияга кирип, анын ферменттик активдүүлүгүн Aebi (1984) ыкмасы боюнча бир аз өзгөртүүлөр менен аныктаган (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Гуайаколго көз каранды пероксидазанын (POX) ферменттик активдүүлүгү Харрах жана башкалардын (2009) ыкмасын колдонуу менен аныкталган. (2008) анча чоң эмес өзгөртүүлөр менен (Эль-Нагар жана башкалар, 2023; Осман жана башкалар, 2023) жана полифенол оксидазанын (ППО) ферментативдик активдүүлүгү 2,2 мл 100 мМ натрий фосфат буфери (рН 6,0), 100 мкл гваяколь (TCI chemicals, Портленд, Орегон, АКШ) жана 100 мкл 12 мМ H2O2 менен реакциядан кийин аныкталган. Ыкма (Эль-Нагар жана башкалар, 2023; Осман жана башкалар, 2023) бир аз өзгөртүлгөн. Анализ 0,1 М фосфат буферинде (рН 6,0) жаңы даярдалган 3 мл катехол эритмеси (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, Массачусетс, АКШ) (0,01 М) менен реакциядан кийин жүргүзүлдү. CAT активдүүлүгү 240 нмде (A240) H2O2 ажыроосун көзөмөлдөө менен өлчөнгөн, POX активдүүлүгү 436 нмде (A436) сиңирүүнүн жогорулашын көзөмөлдөө менен өлчөнгөн, ал эми PPO активдүүлүгү UV-160A спектрофотометрин (Шимадзу, Япония) колдонуп, 495 нмде (A495) сиңирүүнүн термелүүлөрүн ар бир 30 секундда 3 мүнөт бою жазып туруу менен өлчөнгөн.
Акыркы дарылоодон 72 саат өткөндөн кийин буурчак жалбырактарындагы (жогорку жагынан экинчи жана үчүнчү толук өнүккөн жалбырактар) пероксисомалдык каталаза (PvCAT1; GenBank Accession № KF033307.1), супероксиддисмутаза (PvSOD; GenBank Accession № XM_068639556.1) жана глутатионредуктаза (PvGR; GenBank Accession № KY195009.1) сыяктуу үч антиоксидантка байланыштуу гендин транскрипт деңгээлин аныктоо үчүн реалдуу убакыттагы RT-ПТР колдонулган. Кыскача айтканда, РНК өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Кытай) аркылуу бөлүнүп алынган. Андан кийин, өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык TOP script™ cDNA Synthesis Kit аркылуу кДНК синтезделген. Жогорудагы үч гендин праймердик ырааттуулугу S3 кошумча таблицасында келтирилген. PvActin-3 (GenBank каттоо номери: XM_068616709.1) үй кожойкесинин гени катары колдонулган жана салыштырмалуу ген экспрессиясы 2-ΔΔCT ыкмасын колдонуу менен эсептелген (Livak жана Schmittgen, 2001). Биотикалык стресстин (кадимки буурчак өсүмдүктөрү менен антракноз козу карынынын Colletotrichum lindemuthianum ортосундагы шайкеш келбеген өз ара аракеттенүү) жана абиотикалык стресстин (кургакчылык, туздуулук, төмөнкү температура) шарттарындагы актиндин туруктуулугу көрсөтүлгөн (Borges et al., 2012).
Башында биз S. sclerotiorumдогу оксалоацетат ацетилгидролаза (OAH) белокторунун геномдук кремний анализин протеин-протеин BLAST куралын (BLASTp 2.15.0+) колдонуп жүргүздүк (Altschul et al., 1997, 2005). Кыскача айтканда, биз S. sclerotiorumдогу гомологиялык белокту картага түшүрүү үчүн суроо ырааттуулугу катары Aspergillus fijiensis CBS 313.89дан (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank кирүү номери XP_040799428.1; 342 аминокислота) жана Penicillium lagenaдан (PlOAH; таксид: 94218; GenBank кирүү номери XP_056833920.1; 316 аминокислота) OAH колдондук (таксид: 5180). BLASTp Улуттук биотехнология маалымат борборунун (NCBI) веб-сайтындагы (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) GenBank'тагы эң акыркы жеткиликтүү S. sclerotiorum геномунун маалыматтарына каршы жүргүзүлдү.
Мындан тышкары, S. sclerotiorumдон алынган болжолдонгон OAH гени (SsOAH) жана A. fijiensis CBS 313.89дан алынган AfOAH жана P. lagenaдан алынган PlOAH эволюциялык анализи жана филогенетикалык дарагы MEGA11деги максималдуу ыктымалдуулук ыкмасын (Tamura et al., 2021) жана JTT матрицага негизделген моделди (Jones et al., 1992) колдонуу менен чыгарылган. Филогенетикалык дарак S. sclerotiorumдон алынган бардык болжолдонгон OAH гендеринин (SsOAH) белок ырааттуулугунун көп тараптуу тегиздөө анализи жана Чектөөлөргө негизделген тегиздөө куралын (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) колдонуу менен суроо ырааттуулугу менен айкалышкан (Papadopoulos жана Agarwala, 2007). Мындан тышкары, S. sclerotiorumдон алынган SsOAHтын эң жакшы дал келген аминокислота тизмектери ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) программасын колдонуу менен суроо тизмектери (AfOAH жана PlOAH) менен тегизделген (Larkin et al., 2007), ал эми тегиздөөдөгү сакталган аймактар ​​ESPript куралы (3.0 версиясы; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php) аркылуу визуалдаштырылган.
Андан тышкары, S. sclerotiorum SsOAH болжолдонгон функционалдык репрезентативдик домендери жана сакталган сайттары InterPro куралын (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) колдонуу менен ар кандай үй-бүлөлөргө интерактивдүү түрдө классификацияланган (Blum et al., 2021). Акырында, болжолдонгон S. sclerotiorum SsOAH үч өлчөмдүү (3D) түзүлүш моделдөөсү Белок Гомологиясы/Аналогия Таануу Кыймылдаткычын (Phyre2 сервер версиясы 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) колдонуу менен жүргүзүлдү (Kelley et al., 2015) жана SWISS-MODEL серверин (https://swissmodel.expasy.org/) колдонуу менен текшерилди (Biasini et al., 2014). Болжолдонгон үч өлчөмдүү структуралар (PDB форматы) UCSF-Chimera пакетин (1.15 версиясы; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) колдонуу менен интерактивдүү түрдө визуалдаштырылган (Петтерсен жана башкалар, 2004).
Sclerotinia sclerotiorum мицелийлериндеги оксалоацетат ацетилгидролазанын (SsOAH; GenBank кирүү номери: XM_001590428.1) транскрипциялык деңгээлин аныктоо үчүн сандык реалдуу убакыттагы флуоресценциялык ПЦР колдонулган. Кыскача айтканда, S. sclerotiorum PDB камтылган колбага эмделип, мицелиялардын өсүшүн стимулдаштыруу үчүн чайкоочу инкубаторго (модель: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 25 ± 2 °C температурада 24 саат бою 150 айн/мин ылдамдыкта жана туруктуу караңгылыкта (24 саат) жайгаштырылган. Андан кийин, клеткалар акыркы IC50 концентрациясында (болжол менен тиешелүүлүгүнө жараша 40 жана 3,2 мг/л) L-орнитин жана Rizolex-T фунгициди менен иштетилип, андан кийин ошол эле шарттарда дагы 24 саат бою өстүрүлгөн. Инкубациядан кийин, культуралар 2500 айн/мин ылдамдыкта 5 мүнөт центрифугаланып, үстүнкү катмар (грибок мицелийи) ген экспрессиясын анализдөө үчүн чогултулган. Ошо сыяктуу эле, инфекцияланган ткандардын бетинде ак көк жана пахта сымал мицелий пайда болгон инфекцияланган өсүмдүктөрдөн инфекциядан кийин 0, 24, 48, 72, 96 жана 120 сааттан кийин грибок мицелийи чогултулган. Грибок мицелийинен РНК алынып, андан кийин жогоруда сүрөттөлгөндөй кДНК синтезделген. SsOAH үчүн праймердик ырааттуулуктар S3 кошумча таблицасында келтирилген. SsActin (GenBank кирүү номери: XM_001589919.1) үй гени катары колдонулган, ал эми салыштырмалуу ген экспрессиясы 2-ΔΔCT ыкмасы менен эсептелген (Livak жана Schmittgen, 2001).
Оксал кислотасы картошка декстроза сорпосунда (PDB) жана Sclerotinia sclerotiorum грибоктук козгогучун камтыган өсүмдүк үлгүлөрүндө Сюй жана Чжандын (2000) ыкмасы боюнча бир аз өзгөртүүлөр менен аныкталган. Кыскача айтканда, S. sclerotiorum изоляттары PDB камтылган колбаларга эмделип, андан кийин мицелиалдык өсүштү стимулдаштыруу үчүн чайкоочу инкубатордо (I2400 модели, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, АКШ) 150 айн/мин ылдамдыкта 25 ± 2 °C температурада 3-5 күн бою туруктуу караңгылыкта (24 саат) өстүрүлгөн. Инкубациядан кийин, грибоктук культура алгач Whatman #1 чыпка кагазы аркылуу чыпкаланып, андан кийин калдык мицелийди алып салуу үчүн 2500 айн/мин ылдамдыкта 5 мүнөт центрифугаланган. Супернатант чогултулуп, оксалатты андан ары сандык аныктоо үчүн 4°C температурада сакталган. Өсүмдүк үлгүлөрүн даярдоо үчүн болжол менен 0,1 г өсүмдүк ткандарынын фрагменттери дистилденген суу менен үч жолу (ар бир жолу 2 мл) экстракцияланган. Андан кийин үлгүлөр 2500 айн/мин ылдамдыкта 5 мүнөт центрифугаланган, үстүнкү катмар кургак түрдө Whatman №1 чыпка кагазы аркылуу чыпкаланып, андан ары талдоо үчүн чогултулган.
Оксал кислотасын сандык анализдөө үчүн реакция аралашмасы айнек тыгындуу түтүктө төмөнкү тартипте даярдалган: 0,2 мл үлгү (же PDB культурасынын фильтраты же оксал кислотасынын стандарттуу эритмеси), 0,11 мл бромфенол көк (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Питтсбург, Пенсильвания, АКШ), 0,198 мл 1 М күкүрт кислотасы (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) жана 0,176 мл 100 мМ калий дихроматы (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портленд, Орегон, АКШ), андан кийин эритме дистилденген суу менен 4,8 мл чейин суюлтулуп, катуу аралаштырылып, дароо 60°C суу мончосуна салынган. 10 мүнөттөн кийин реакция 0,5 мл натрий гидроксидинин эритмесин (NaOH; 0,75 М) кошуу менен токтотулган. Реакциялык аралашманын абсорбциясы (A600) 600 нмде UV-160 спектрофотометри (Shimadzu Corporation, Япония) аркылуу өлчөнгөн. Культуралык фильтраттарды жана өсүмдүк үлгүлөрүн сандык аныктоо үчүн PDB жана дистилденген суу тиешелүү түрдө контролдук катары колдонулган. Культуралык фильтраттардагы оксалат кислотасынын концентрациясы, PDB чөйрөсүнүн миллилитриндеги оксалат кислотасынын микрограммдары (μg.mL−1) жана жалбырак экстракттарындагы, жаңы салмактын бир граммындагы оксалат кислотасынын микрограммдары (μg.g−1 FW) катары көрсөтүлгөн, оксалат кислотасын калибрлөө ийри сызыгын колдонуу менен аныкталган (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, АКШ).
Изилдөө учурунда бардык эксперименттер толугу менен рандомизацияланган дизайнда (CRD) иштелип чыккан, башкача көрсөтүлбөсө, ар бир дарылоодо алты биологиялык кайталоо жана ар бир биологиялык кайталоодо беш идиш (ар бир идиште эки өсүмдүк) болгон. Биологиялык кайталоолор кайталанган түрдө талданган (эки техникалык кайталоо). Техникалык кайталоолор бир эле эксперименттин кайталанышын текшерүү үчүн колдонулган, бирок жасалма кайталоолорду болтурбоо үчүн статистикалык анализде колдонулган эмес. Маалыматтар дисперсияны талдоо (ANOVA), андан кийин Туки-Крамердин чынчыл маанилүү айырмасы (HSD) тести (p ≤ 0,05) колдонулуп, статистикалык жактан талданган. In vitro эксперименттери үчүн IC50 жана IC99 маанилери пробит моделин колдонуу менен эсептелген жана 95% ишеним аралыктары эсептелген.
Египеттин Эль-Габия губернаторлугундагы ар кандай соя талааларынан жалпысынан төрт изолят чогултулган. PDA чөйрөсүндө бардык изоляттар каймак сымал ак мицелийди пайда кылган, ал тез эле пахта сымал ак түскө айланган (1А-сүрөт), андан кийин склеротий стадиясында беж же күрөң түскө айланган. Склеротийлер адатта тыгыз, кара, тоголок же туура эмес формада болот, узундугу 5,2ден 7,7 ммге чейин жана диаметри 3,4төн 5,3 ммге чейин (1B-сүрөт). Төрт изолят 25 ± 2 °C температурада 10–12 күн инкубациялангандан кийин культуралык чөйрөнүн четинде склеротийдин четки үлгүсүн пайда кылганы менен (1А-сүрөт), алардын арасында бир пластинадагы склеротийлердин саны бир топ айырмаланган (P < 0,001), 3-изолятта склеротийлердин саны эң көп болгон (бир пластинада 32,33 ± 1,53 склеротий; 1C-сүрөт). Ошо сыяктуу эле, №3 изоляты PDBде башка изоляттарга караганда көбүрөөк оксал кислотасын өндүргөн (3,33 ± 0,49 мкг.мл−1; 1D-сүрөт). №3 изоляты фитопатогендик козу карын Sclerotinia sclerotiorumдун типтүү морфологиялык жана микроскопиялык мүнөздөмөлөрүн көрсөткөн. Мисалы, PDAда №3 изолятынын колониялары тез өсүп, каймактай ак (1А-сүрөт), тескери беж же ачык лосось сары-күрөң түстө болуп, 9 см диаметрдеги пластинанын бетин толугу менен жабуу үчүн 25 ± 2°C температурада 6-7 күн талап кылынган. Жогорудагы морфологиялык жана микроскопиялык мүнөздөмөлөрдүн негизинде №3 изоляты Sclerotinia sclerotiorum катары аныкталган.
Сүрөт 1. Кадимки буурчак өсүмдүктөрүнөн алынган S. sclerotiorum изоляттарынын мүнөздөмөсү жана патогендүүлүгү. (A) PDA чөйрөсүндөгү төрт S. sclerotiorum изолятынын мицелийдик өсүшү, (B) төрт S. sclerotiorum изолятынын склеротиясы, (C) склеротиянын саны (бир пластинада), (D) PDB чөйрөсүндөгү оксал кислотасынын бөлүнүп чыгышы (мкг.мЛ−1) жана (E) күнөскана шарттарында Giza 3 сезгич коммерциялык буурчак сортундагы төрт S. sclerotiorum изолятынын оорунун оордугу (%). Маанилер беш биологиялык кайталоонун орточо ± SD маанисин билдирет (n = 5). Ар кандай тамгалар дарылоонун ортосундагы статистикалык жактан маанилүү айырмачылыктарды көрсөтөт (p < 0,05). (F–H) 3-изолят (dpi) менен эмдөөдөн 10 күн өткөндөн кийин, жер үстүндөгү сабактарда жана силикаларда ак көктүн типтүү белгилери пайда болгон. (I) S. sclerotiorum #3 изолятынын ички транскрипцияланган спейсер (ITS) аймагынын эволюциялык анализи максималдуу ыктымалдуулук ыкмасын колдонуу менен жүргүзүлдү жана Улуттук биотехнологиялык маалымат борборунун (NCBI) маалымат базасынан (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) алынган 20 эталондук изолят/штамм менен салыштырылды. Кластерлөө сызыктарынын үстүндөгү сандар аймактын камтуусун (%), ал эми кластерлөө сызыктарынын астындагы сандар бутактын узундугун көрсөтөт.
Андан тышкары, патогендүүлүгүн ырастоо үчүн, алынган төрт S. sclerotiorum изоляттары Giza 3 коммерциялык буурчак сортун күнөскана шарттарында эмдөө үчүн колдонулган, бул Кохтун постулаттарына дал келет (1E-сүрөт). Алынган бардык грибоктук изоляттар патогендүү болуп, жашыл буурчакты жугузуп алышы мүмкүн (Giza 3 деп которсоңуз), жер үстүндөгү бардык бөлүктөрүндө (1F-сүрөт), айрыкча сабактарында (1G-сүрөт) жана кабыктарында (1H-сүрөт) эмдөөдөн 10 күн өткөндөн кийин (dpi) ак көктүн типтүү симптомдорун пайда кылышы мүмкүн болсо да, 3-изолят эки көз карандысыз экспериментте эң агрессивдүү изолят болгон. 3-изолят буурчак өсүмдүктөрүндө оорунун эң жогорку деңгээлине (%) ээ болгон (инфекциядан кийин 7, 14 жана 21 күндө тиешелүүлүгүнө жараша 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 жана 76,7 ± 3,1; 1F-сүрөт).
Эң инвазивдүү S. sclerotiorum #3 изолятын аныктоо ички транскрипцияланган спейсердик (ITS) секвенирлөөнүн негизинде андан ары тастыкталды (1I-сүрөт). #3 изоляты менен 20 эталондук изолят/штаммдын ортосундагы филогенетикалык анализ алардын ортосунда жогорку окшоштукту (>99%) көрсөттү. Белгилей кетүүчү нерсе, S. sclerotiorum #3 изоляты (533 б.п.) кургак буурчактын данектеринен бөлүнүп алынган америкалык S. sclerotiorum LPM36 изоляты (GenBank каттоо номери MK896659.1; 540 б.п.) жана кытайлык S. sclerotiorum YKY211 изоляты (GenBank каттоо номери OR206374.1; 548 б.п.) менен жогорку окшоштукка ээ, ал фиалка (Matthiola incana) сабагынын чиришин пайда кылат, алардын баары дендрограмманын жогору жагында өзүнчө топтолгон (1I-сүрөт). Жаңы ырааттуулук NCBI маалымат базасына сакталып, "Sclerotinia sclerotiorum – YN-25 изолят" деп аталды (GenBank каттоо номери PV202792). 3-изолят эң инвазивдүү изолят экенин көрүүгө болот; ошондуктан, бул изолят кийинки бардык эксперименттерде изилдөө үчүн тандалып алынган.
Диамин L-орнитининин (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) ар кандай концентрацияларда (12,5, 25, 50, 75, 100 жана 125 мг/л) S. sclerotiorum изоляты 3кө каршы антибактериалдык активдүүлүгү in vitro шартында изилденген. Белгилей кетүүчү нерсе, L-орнитин антибактериалдык таасир көрсөтүп, S. sclerotiorum hyphaeнин радиалдык өсүшүн дозага көз каранды түрдө акырындык менен баскан (2A, B сүрөттөрү). Сыналган эң жогорку концентрацияда (125 мг/л) L-орнитин мицелийдин өсүшүн басуунун эң жогорку ылдамдыгын (99,62 ± 0,27%; 2B сүрөттөрү) көрсөттү, бул сыналган эң жогорку концентрацияда (10 мг/л) Rizolex-T коммерциялык фунгицидине барабар болгон (басуу ылдамдыгы 99,45 ± 0,39%; 2C сүрөттөрү), бул окшош эффективдүүлүктү көрсөтүп турат.
Сүрөт 2. L-орнитиндин Sclerotinia sclerotiorumга каршы in vitro антибактериалдык активдүүлүгү. (A) L-орнитиндин S. sclerotiorumга каршы ар кандай концентрацияларынын антибактериалдык активдүүлүгүн коммерциялык фунгицид Rizolex-T (10 мг/л) менен салыштыруу. (B, C) L-орнитиндин ар кандай концентрациялары (12,5, 25, 50, 75, 100 жана 125 мг/л) же Rizolex-T (2, 4, 6, 8 жана 10 мг/л) менен дарылоодон кийин S. sclerotiorum мицелийинин өсүшүнүн ингибирлөө ылдамдыгы (%). Маанилер беш биологиялык кайталоонун орточо ± SD маанисин билдирет (n = 5). Ар кандай тамгалар дарылоонун ортосундагы статистикалык айырмачылыктарды билдирет (p < 0,05). (D, E) L-орнитиндин жана коммерциялык фунгицид Rizolex-Tнин пробит моделинин регрессиялык анализи тиешелүүлүгүнө жараша. Пробит моделинин регрессия сызыгы көк түстөгү сызык катары, ал эми ишеним аралыгы (95%) кызыл үзүк сызык катары көрсөтүлгөн.
Мындан тышкары, пробит регрессиясынын анализи жүргүзүлдү жана тиешелүү графиктер 1-таблицада жана 2D, E сүрөттөрүндө көрсөтүлгөн. Кыскача айтканда, L-орнитиндин алгылыктуу жантайыңкы мааниси (y = 2.92x − 4.67) жана ага байланыштуу маанилүү статистика (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 жана p < 0.0001; 2D сүрөт) коммерциялык фунгицид Rizolex-Tге салыштырмалуу S. sclerotiorumга каршы грибокко каршы активдүүлүгүнүн жогорулаганын көрсөттү (y = 1.96x − 0.99, Cox & Snell R2 = 0.1242, Nagelkerke R2 = 0.1708 жана p < 0.0001) (1-таблица).
1-таблица. S. sclerotiorumга каршы L-орнитиндин жана коммерциялык "Rizolex-T" фунгицидинин жарым максималдуу ингибирлөөчү концентрациясынын (IC50) жана IC99 (мг/л) маанилери.
Жалпысынан алганда, L-орнитин (250 мг/л) дарыланбаган S. sclerotiorum менен инфекцияланган өсүмдүктөргө салыштырмалуу дарыланган кадимки буурчак өсүмдүктөрүндө ак көктүн пайда болушун жана оордугун бир топ төмөндөткөн (контролдук; 3A-сүрөт). Кыскасы, дарыланбаган инфекцияланган контролдук өсүмдүктөрдүн оорунун оордугу акырындык менен жогорулаганы менен (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 жана 92,33 ± 3,06%), L-орнитин эксперименттин жүрүшүндө оорунун оордугун (%) дарылоодон кийин 7, 14 жана 21 күндөн кийин (dpt) бир топ төмөндөткөн (3A-сүрөт). Ошо сыяктуу эле, S. sclerotiorum менен ооруган буурчак өсүмдүктөрү 250 мг/л L-орнитин менен дарыланганда, оорунун өнүгүшүнүн ийри сызыгынын астындагы аянт (AUDPC) дарыланбаган контролдук топтогу 1274,33 ± 33,13төн 281,03 ± 7,95ке чейин төмөндөгөн, бул оң контролдук топтогу 50 мг/л Rizolex-T фунгицидинен бир аз төмөн болгон (183,61 ± 7,71; 3B-сүрөт). Экинчи экспериментте да ушундай эле тенденция байкалган.
Сүрөт 3. L-орнитинди экзогендик колдонуунун күнөскана шарттарында Sclerotinia sclerotiorum козгогон кадимки буурчактын ак чиригинин өнүгүшүнө тийгизген таасири. (A) 250 мг/л L-орнитин менен дарылангандан кийин кадимки буурчактын ак көктүн оорунун өнүгүшүнүн ийри сызыгы. (B) L-орнитин менен дарылангандан кийин кадимки буурчактын ак көктүн оорунун өнүгүшүнүн ийри сызыгынын астындагы аянт (AUDPC). Маанилер беш биологиялык кайталоонун орточо ± SD маанисин билдирет (n = 5). Ар кандай тамгалар дарылоонун ортосундагы статистикалык жактан маанилүү айырмачылыктарды билдирет (p < 0,05).
250 мг/л L-орнитинди экзогендик колдонуу 42 күндөн кийин өсүмдүктүн бийиктигин (4А-сүрөт), өсүмдүктөгү бутактардын санын (4В-сүрөт) жана өсүмдүктөгү жалбырактардын санын (4С-сүрөт) акырындык менен жогорулаткан. Коммерциялык фунгицид Rizolex-T (50 мг/л) изилденген бардык азыктык параметрлерге эң чоң таасир этсе, 250 мг/л L-орнитинди экзогендик колдонуу дарыланбаган контролдук топко салыштырмалуу экинчи чоң таасирге ээ болгон (4А–С-сүрөттөр). Башка жагынан алганда, L-орнитин менен дарылоо фотосинтетикалык пигменттердин хлорофилл а (4D-сүрөт) жана хлорофилл b (4E-сүрөт) курамына олуттуу таасир эткен жок, бирок терс контролго (0,44 ± 0,02 мг/г fr wt) жана оң контролго (0,46 ± 0,02 мг/г fr wt; 4F-сүрөт) салыштырмалуу жалпы каротиноиддердин курамын (0,56 ± 0,03 мг/г fr wt) бир аз жогорулаткан. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар L-орнитин дарыланган буурчак өсүмдүктөрү үчүн фитотоксикалык эмес экенин жана ал тургай алардын өсүшүн стимулдаштырышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Сүрөт 4. Экзогендик L-орнитинди колдонуунун күнөскана шарттарында Sclerotinia sclerotiorum менен жуккан буурчак жалбырактарынын өсүү мүнөздөмөлөрүнө жана фотосинтетикалык пигменттерине тийгизген таасири. (A) Өсүмдүктүн бийиктиги (см), (B) Өсүмдүктүн бутактарынын саны, (C) Өсүмдүктүн жалбырактарынын саны, (D) Хлорофиллдин курамы (мг г-1 fr салмагы), (E) Хлорофиллдин курамы (мг г-1 fr салмагы), (F) Каротиноиддин жалпы курамы (мг г-1 fr салмагы). Маанилер беш биологиялык кайталоонун орточо ± SD мааниси (n = 5). Ар кандай тамгалар дарылоонун ортосундагы статистикалык жактан маанилүү айырмачылыктарды көрсөтөт (p < 0,05).
Реактивдүү кычкылтек түрлөрүнүн (ROS; суутек перекиси [H2O2] катары көрсөтүлгөн) жана эркин радикалдардын (супероксид аниондору [O2•−] катары көрсөтүлгөн) in situ гистохимиялык локализациясы L-орнитинди (250 мг/л) экзогендик колдонуу дарыланбаган инфекцияланган өсүмдүктөрдүн (тиешелүүлүгүнө жараша 173,31 ± 12,06 жана 149,35 ± 7,94 нмоль.г−1 FW) жана 50 мг/л коммерциялык Rizolex-T фунгициди менен дарыланган өсүмдүктөрдүн (тиешелүүлүгүнө жараша 170,12 ± 9,50 жана 157,00 ± 7,81 нмоль.г−1 fr wt) топтолушуна салыштырмалуу H2O2 (96,05 ± 5,33 нмоль.г−1 FW; 5А-сүрөт) жана O2•− (32,69 ± 8,56 нмоль.г−1 FW; 5В-сүрөт) топтолушун бир кыйла азайтканын көрсөттү. 72 саатта. HPT астында H2O2 жана O2•− жогорку деңгээлде топтолгон (5A, B сүрөттөрү). Ошо сыяктуу эле, TCA негизиндеги малониальдегид (MDA) анализи S. sclerotiorum менен инфекцияланган буурчак өсүмдүктөрүнүн жалбырактарында MDAнын жогорку деңгээли (113,48 ± 10,02 нмоль.г fr wt) топтолгонун көрсөттү (5C сүрөт). Бирок, L-орнитинди экзогендик колдонуу липиддердин пероксидациясын бир кыйла төмөндөттү, бул дарыланган өсүмдүктөрдө MDAнын курамынын төмөндөшү менен далилденет (33,08 ± 4,00 нмоль.г fr wt).
Сүрөт 5. Парник шарттарында инфекциядан кийин 72 сааттан кийин S. sclerotiorum менен жабыркаган буурчак жалбырактарында кычкылдануу стрессинин негизги маркерлерине жана ферменттик эмес антиоксиданттык коргонуу механизмдерине экзогендик L-орнитинди колдонуунун таасири. (A) 72 аттын күчүндө суутек перекиси (H2O2; нмоль г−1 FW), (B) 72 аттын күчүндө супероксид аниону (O2•−; нмоль г−1 FW), (C) малониальдегид (MDA; нмоль г−1 FW) 72 аттын күчүндө, (D) 72 аттын күчүндө жалпы эрүүчү фенолдор (мг GAE г−1 FW), (E) 72 аттын күчүндө жалпы эрүүчү флавоноиддер (мг RE г−1 FW), (F) 72 аттын күчүндө жалпы эркин аминокислоталар (мг г−1 FW) жана (G) 72 аттын күчүндө пролиндин курамы (мг г−1 FW). Маанилер 5 биологиялык кайталоонун орточо ± стандарттык четтөөсүн (орточо ± SD) билдирет (n = 5). Ар кандай тамгалар дарылоонун ортосундагы статистикалык жактан маанилүү айырмачылыктарды көрсөтөт (p < 0,05).