Биз мурда боор фиброзу менен ооругандарда ичегиден алынган триптофан метаболити индол-3-пропион кислотасынын (IPA) кан сары суусундагы деңгээли төмөн экенин билдиргенбиз. Бул изилдөөдө биз семиз боорлордогу транскриптомду жана ДНК метиломун кан сары суусундагы IPA деңгээлине байланыштуу, ошондой эле in vitro шартында боордун жылдызча клеткаларынын (HSC) фенотиптик инактивациясын индукциялоодогу IPAнын ролун изилдедик.
Изилдөөгө Куопио Бариатриялык Хирургия Борборунда (KOBS) бариатриялык операция жасалган, 2-типтеги кант диабети (Т2ДМ) менен оорубаган 116 семиз бейтап (46,8 ± 9,3 жаш; Дене салмагынын индекси: 42,7 ± 5,0 кг/м²) катышкан. Циркуляциялык IPA деңгээли суюк хроматография-массалык спектрометрия (LC-MS) менен өлчөнгөн, боор транскриптомунун анализи жалпы РНК секвенирлөө жолу менен жүргүзүлгөн жана ДНК метилденүүсүнүн анализи Infinium HumanMethylation450 BeadChip колдонуу менен жүргүзүлгөн. In vitro эксперименттери үчүн адамдын боорунун жылдызча клеткалары (LX-2) колдонулган.
Сывороткадагы IPA деңгээли боордогу апоптоздук, митофагиялык жана узак жашоо жолдоруна катышкан гендердин экспрессиясы менен корреляцияланган. AKT серин/треонин киназа 1 (AKT1) гени боордун транскриптинде жана ДНК метилденүү профилдеринде эң көп кездешкен жана доминанттык өз ара аракеттенүүчү ген болгон. IPA менен дарылоо апоптозду, митохондриялык дем алуунун төмөндөшүн жана LX-2 клеткаларынын фиброзду, апоптозду жана жашоону жөнгө салуучу белгилүү гендердин экспрессиясын модуляциялоо менен клетка морфологиясын жана митохондриялык динамикасын өзгөрткөн.
Жалпысынан алганда, бул маалыматтар IPA потенциалдуу терапиялык таасирлерге ээ экенин жана апоптозду индукциялап, HSC фенотипин активдүү эмес абалга жылдыра аларын, ошону менен HSC активациясына жана митохондриялык метаболизмге кийлигишүү менен боор фиброзун басуу мүмкүнчүлүгүн кеңейтерин тастыктайт.
Семирүүнүн жана зат алмашуу синдромунун таралышы зат алмашуу менен байланышкан майлуу боор оорусунун (MASLD) көбөйүшү менен байланыштуу; бул оору жалпы калктын 25% дан 30% га чейин таасир этет [1]. MASLD этиологиясынын негизги кесепети - боор фиброзу, бул жипче клеткадан тышкаркы матрицанын (ECM) тынымсыз топтолушу менен мүнөздөлгөн динамикалык процесс [2]. Боор фиброзуна катышкан негизги клеткалар - бул төрт белгилүү фенотипти көрсөткөн боор жылдызча клеткалары (HSCs): тынч абалдагы, активдештирилген, инактивдештирилген жана картаюу [3, 4]. HSCs активдештирилип, тынч абалдан жогорку энергияны талап кылган пролиферативдик фибробласт сымал клеткаларга трансдифференциацияланышы мүмкүн, бул α-жылмакай булчуң актининин (α-SMA) жана I типтеги коллагендин (Col-I) экспрессиясынын жогорулашы менен коштолот [5, 6]. Боор фиброзунун калыбына келиши учурунда активдештирилген HSCs апоптоз же инактивдештирүү аркылуу жок кылынат. Бул процесстерге фиброгендик гендердин төмөндөшү жана просирвивалдык гендердин модуляциясы (мисалы, NF-κB жана PI3K/Akt сигнал берүү жолдору) [7, 8], ошондой эле митохондриялык динамикадагы жана функциядагы өзгөрүүлөр кирет [9].
Ичегиде өндүрүлгөн триптофан метаболити индол-3-пропион кислотасынын (IPA) сывороткадагы деңгээли MASLDди кошкондо адамдын зат алмашуу ооруларында төмөндөгөнү аныкталган [10–13]. IPA тамак-аш буласын кабыл алуу менен байланыштуу, антиоксидант жана сезгенүүгө каршы таасири менен белгилүү жана диетадан улам пайда болгон алкоголсуз стеатогепатиттин (NASH) фенотипин in vivo жана in vitro шартында басаңдатат [11–14]. Айрым далилдер биздин мурунку изилдөөбүздөн алынган, анда Куопио бариатриялык хирургиялык изилдөөсүндө (KOBS) боор фиброзу бар бейтаптарда боор фиброзу жок семиз бейтаптарга караганда сывороткадагы IPA деңгээли төмөн экени көрсөтүлгөн. Андан тышкары, биз IPA менен дарылоо адамдын боор жылдызча клеткасында (LX-2) клеткалардын адгезиясынын, клеткалардын миграциясынын жана гемопоэтикалык өзөк клеткаларынын активдешүүсүнүн классикалык маркерлери болгон гендердин экспрессиясын азайта аларын жана потенциалдуу гепатопротектордук метаболит болуп саналаарын көрсөттүк [15]. Бирок, IPA HSC апоптозун жана митохондриялык биоэнергетиканы активдештирүү менен боор фиброзунун регрессиясын кантип индукциялай турганы белгисиз бойдон калууда.
Бул жерде биз сывороткалык IPA семиз, бирок 2-типтеги диабет (KOBS) менен оорубаган адамдардын боорунда апоптоз, митофагия жана узак жашоо жолдоруна бай гендердин экспрессиясы менен байланыштуу экенин көрсөтөбүз. Андан тышкары, биз IPA инактивация жолу аркылуу активдештирилген гемопоэтикалык өзөк клеткаларынын (HSC) тазаланышын жана деградациясын индукциялай аларын аныктадык. Бул жыйынтыктар IPAнын жаңы ролун ачып, аны боор фиброзунун регрессиясын илгерилетүү үчүн потенциалдуу терапиялык максатка айландырат.
KOBS когортасындагы мурунку изилдөө боор фиброзу менен ооругандардын кан айлануусундагы IPA деңгээли боор фиброзу жок бейтаптарга салыштырмалуу төмөн экенин көрсөткөн [15]. 2-типтеги диабеттин мүмкүн болгон аралаштыруучу таасирин жокко чыгаруу үчүн, биз уланып жаткан KOBS изилдөөсүнөн изилдөө популяциясы катары 2-типтеги диабетсиз 116 семиздик менен ооругандарды (орточо жашы ± SD: 46,8 ± 9,3 жаш; BMI: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (1-таблица) тандап алдык [16]. Бардык катышуучулар жазуу жүзүндө макулдук беришкен жана изилдөө протоколу Хельсинки декларациясына (54/2005, 104/2008 жана 27/2010) ылайык Түндүк Саво округунун ооруканасынын этика комитети тарабынан бекитилген.
Боордун биопсиясынын үлгүлөрү бариатриялык хирургия учурунда алынып, тажрыйбалуу патологоанатомдор тарабынан мурда сүрөттөлгөн критерийлерге ылайык гистологиялык жактан бааланган [17, 18]. Баалоо критерийлери S1 кошумча таблицасында кыскача баяндалган жана мурда сүрөттөлгөн [19].
Ачка кан сары суусунун үлгүлөрү метаболомиканы талдоо үчүн максаттуу эмес суюк хроматография-массалык спектрометрия (LC-MS) аркылуу талданган (n = 116). Үлгүлөр мурда сүрөттөлгөндөй UHPLC-qTOF-MS системасы (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Германия) аркылуу талданган19. Изопропил спиртин (IPA) аныктоо кармоо убактысына жана MS/MS спектрин таза стандарттар менен салыштырууга негизделген. IPA сигналынын интенсивдүүлүгү (чоку аймагы) бардык андан аркы талдоолордо эске алынган [20].
Боордун РНКсын секвенирлөө Illumina HiSeq 2500 колдонуу менен жүргүзүлдү жана маалыматтар мурда сүрөттөлгөндөй алдын ала иштетилди [19, 21, 22]. Биз MitoMiner 4.0 маалымат базасынан тандалган 1957 генди колдонуп, митохондриялык функцияга/биогенезге таасир этүүчү транскрипттердин максаттуу дифференциалдык экспрессиясын талдоо жүргүздүк [23]. Боордун ДНКсынын метилденүүсүн талдоо мурда сүрөттөлгөндөй эле методологияны колдонуу менен Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, АКШ) колдонуу менен жүргүзүлдү [24, 25].
Адамдын боорунун жылдыз сымал клеткалары (LX-2) профессор Стефано Ромео тарабынан берилген жана алар DMEM/F12 чөйрөсүндө (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106) өстүрүлүп, сакталган. IPAнын жумушчу дозасын тандоо үчүн, LX-2 клеткалары DMEM/F12 чөйрөсүндө 24 саат бою IPAнын ар кандай концентрациялары (10 мкМ, 100 мкМ жана 1 мМ; Sigma, 220027) менен иштетилген. Андан тышкары, IPAнын HSCлерди инактивдештирүү жөндөмүн изилдөө үчүн, LX-2 клеткалары 24 саат бою сывороткасыз чөйрөдө 5 нг/мл TGF-β1 (R&D системалары, 240-B-002/CF) жана 1 мМ IPA менен бирге иштетилген. Тийиштүү унаа башкаруу элементтери үчүн TGF-β1 дарылоо үчүн 0,1% BSA камтыган 4 нМ HCL жана IPA дарылоо үчүн 0,05% DMSO колдонулган жана экөө тең айкалышкан дарылоо үчүн чогуу колдонулган.
Апоптоз өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык, FITC Annexin V апоптозду аныктоо комплектиси менен 7-AAD (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, АКШ, Cat# 640922) аркылуу бааланган. Кыскача айтканда, LX-2 (1 × 105 клетка/кутуча) 12 кутучалуу плиталарда түнү бою өстүрүлүп, андан кийин IPA же IPA жана TGF-β1дин бир нече дозасы менен иштетилген. Кийинки күнү калкып жүрүүчү жана жабышкан клеткалар чогултулуп, трипсиндештирилип, PBS менен жуулуп, Annexin V байланыштыруучу буферинде кайра эритилип, FITC-Annexin V жана 7-AAD менен 15 мүнөт инкубацияланган.
Тирүү клеткалардагы митохондриялар кычкылдануу активдүүлүгү үчүн Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) колдонуп боёлгон. MTR анализдери үчүн LX-2 клеткалары IPA жана TGF-β1 менен бирдей тыгыздыкта инкубацияланган. 24 сааттан кийин тирүү клеткалар трипсиндештирилип, PBS менен жуулуп, андан кийин мурда сүрөттөлгөндөй [26] 37°C температурада 20 мүнөт бою сывороткасыз чөйрөдө 100 мкМ MTR менен инкубацияланган. Тирүү клеткалардын морфологиясын талдоо үчүн клетканын өлчөмү жана цитоплазмалык татаалдыгы тиешелүүлүгүнө жараша алдыга чачыратуу (FSC) жана каптал чачыратуу (SSC) параметрлерин колдонуу менен талданган.
Бардык маалыматтар (30 000 окуя) NovoCyte Quanteon (Agilent) аркылуу чогултулуп, NovoExpress® 1.4.1 же FlowJo V.10 программалык камсыздоосу аркылуу талданды.
Кычкылтек керектөө ылдамдыгы (OCR) жана клеткадан тышкаркы кычкылдануу ылдамдыгы (ECAR) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык Seahorse XF Cell Mito Stress менен жабдылган Seahorse Extracellular Flux Analyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) аркылуу реалдуу убакыт режиминде өлчөнгөн. Кыскача айтканда, 2 × 104 LX-2 клеткалары/кутучалар XF96 клетка культурасынын плиталарына себилген. Түнкү инкубациядан кийин клеткалар изопропанол (IPA) жана TGF-β1 (кошумча методдор 1) менен иштетилген. Маалыматтарды талдоо Seahorse XF Cell Energy Phenotype Test Report Generator камтыган Seahorse XF Wave программасын колдонуу менен жүргүзүлдү. Мындан биоэнергетикалык ден соолук индекси (BHI) эсептелген [27].
Жалпы РНК кДНКга транскрипцияланган. Белгилүү бир ыкмалар үчүн [15] шилтемесин караңыз. Адамдын 60S рибосомалык кислоталык белогу P0 (RPLP0) жана циклофилин A1 (PPIA) мРНК деңгээлдери гендин негизги көзөмөлү катары колдонулган. QuantStudio 6 pro Real-Time PCR системасы (Thermo Fisher, Landsmeer, Нидерланды) TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) же Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050) менен колдонулган жана гендин салыштырмалуу экспрессиясынын бүктөлүшү салыштырмалуу Ct маанисинин цикл параметрлерин (ΔΔCt) жана ∆∆Ct ыкмасын колдонуу менен эсептелген. Праймерлердин чоо-жайы S2 жана S3 кошумча таблицаларында берилген.
Ядролук ДНК (ncDNA) жана митохондриялык ДНК (mtDNA) мурда сүрөттөлгөндөй [28] DNeasy кан жана ткандар комплекти (Qiagen) аркылуу алынган. mtDNAнын салыштырмалуу көлөмү ар бир максаттуу mtDNA аймагынын үч ядролук ДНК аймагынын (mtDNA/ncDNA) геометриялык орточо маанисине катышын эсептөө менен эсептелген, бул тууралуу 2-кошумча ыкмаларда кеңири баяндалган. mtDNA жана ncDNA үчүн праймерлердин чоо-жайы S4-кошумча таблицада берилген.
Тирүү клеткалар клетка аралык жана клетка ичиндеги митохондриялык тармактарды визуалдаштыруу үчүн Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Карлсбад, Калифорния) менен боёлгон. LX-2 клеткалары (1 × 104 клетка/кудук) тиешелүү айнек түптүү культуралык плиталардагы (Ibidi GmbH, Мартинсрид, Германия) айнек слайддарда өстүрүлгөн. 24 сааттан кийин тирүү LX-2 клеткалары 37°C температурада 20 мүнөт 100 мкМ MTR менен инкубацияланган жана клетка ядролору мурда сүрөттөлгөндөй DAPI (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich) менен боёлгон [29]. Митохондриялык тармактар ​​37°C температурада 5% CO2 менен нымдалган атмосферада 63×NA 1.3 объективди колдонуп, Zeiss LSM 800 конфокалдык модулу менен жабдылган Zeiss Axio Observer инверттелген микроскобу (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия) аркылуу визуалдаштырылган. Ар бир үлгү түрү үчүн биз он Z сериялуу сүрөттөрдү алдык. Ар бир Z сериясында ар биринин калыңдыгы 9,86 мкм болгон 30 бөлүк бар. Ар бир үлгү үчүн ZEN 2009 программасын (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия) колдонуу менен он түрдүү көрүү талаасынын сүрөттөрү алынды, ал эми митохондриялык морфологиялык анализ ImageJ программасын (v1.54d) [30, 31] колдонуу менен Кошумча ыкмаларда 3 кеңири баяндалган параметрлерге ылайык жүргүзүлдү.
Клеткалар 0,1 М фосфат буферинде 2% глутаральдегид менен фиксацияланган, андан кийин 1% осмий тетроксидинин эритмеси (Sigma Aldrich, MO, АКШ) менен фиксацияланган, ацетон менен акырындык менен кургатылган (Merck, Darmstadt, Германия) жана акырында эпоксид чайырына салынган. Өтө жука кесилиштер даярдалып, 1% уранил ацетат (Merck, Darmstadt, Германия) жана 1% коргошун цитраты (Merck, Darmstadt, Германия) менен боёлгон. Өтө структуралык сүрөттөр 80 кВ ылдамдатуучу чыңалууда JEM 2100F EXII өткөргүч электрондук микроскобу (JEOL Ltd, Токио, Япония) аркылуу алынган.
24 саат бою IPA менен дарыланган LX-2 клеткаларынын морфологиясы Zeiss тескери жарык микроскобун (Zeiss Axio Vert.A1 жана AxioCam MRm, Йена, Германия) колдонуу менен 50 эсе чоңойтуу менен фазалык контрасттуу микроскопия аркылуу талданды.
Клиникалык маалыматтар орточо ± стандарттык четтөө же медиана (квартилдер аралык диапазон: IQR) катары көрсөтүлгөн. Үч изилдөө тобунун ортосундагы айырмачылыктарды салыштыруу үчүн дисперсиянын бир тараптуу анализи (үзгүлтүксүз өзгөрмөлөр) же χ² тести (категориялык өзгөрмөлөр) колдонулган. Жалган оң көрсөткүч (FDR) бир нече тестирлөөнү оңдоо үчүн колдонулган жана FDR < 0,05 болгон гендер статистикалык жактан маанилүү деп эсептелген. CpG ДНК метилденүүсүн IPA сигналынын интенсивдүүлүгү менен байланыштыруу үчүн Спирмен корреляциясын анализдөө колдонулган, номиналдык p маанилери (p < 0,05) көрсөтүлгөн.
Кан айлануучу IPA деңгээли менен байланышкан 268 транскрипт (номиналдык p < 0.01), 119 митохондрия менен байланышкан транскрипт (номиналдык p < 0.05) жана боордун 3093 транскриптинин ичинен 4350 CpG үчүн веб-негизделген ген топтомун талдоо куралын (WebGestalt) колдонуу менен жолду талдоо жүргүзүлдү. Эркин жеткиликтүү Venny DB (2.1.0 версиясы) куралы бири-бирине дал келген гендерди табуу үчүн, ал эми StringDB (11.5 версиясы) белок-белок өз ара аракеттенүүсүн визуалдаштыруу үчүн колдонулган.
LX-2 эксперименти үчүн үлгүлөр нормалдуулугуна Д'Агостино-Пирсон тести аркылуу текшерилген. Маалыматтар кеминде үч биологиялык кайталоодон алынган жана Бонферрони пост-хок тести менен бир тараптуу ANOVAга дуушар болгон. 0,05тен аз p-мааниси статистикалык жактан маанилүү деп эсептелген. Маалыматтар орточо ± SD катары берилген жана ар бир сүрөттө эксперименттердин саны көрсөтүлгөн. Бардык анализдер жана графиктер Windows үчүн GraphPad Prism 8 статистикалык программасын колдонуу менен жүргүзүлдү (GraphPad Software Inc., 8.4.3 версиясы, Сан-Диего, АКШ).
Алгач, биз кан сары суусундагы IPA деңгээлинин боор, бүт дене жана митохондриялык транскрипттер менен байланышын изилдедик. Жалпы транскрипт профилинде кан сары суусундагы IPA деңгээли менен байланышкан эң күчтүү ген MAPKAPK3 болгон (FDR = 0,0077; митоген менен активдештирилген протеинкиназа менен активдештирилген протеинкиназа 3); митохондрия менен байланышкан транскрипт профилинде эң күчтүү байланышкан ген AKT1 болгон (FDR = 0,7621; AKT серин/треонин киназа 1) (Кошумча файл 1 жана Кошумча файл 2).
Андан кийин биз глобалдык транскрипттерди (n = 268; p < 0.01) жана митохондрия менен байланышкан транскрипттерди (n = 119; p < 0.05) талдап, акырында апоптозду эң маанилүү канондук жол катары аныктадык (p = 0.0089). Кан сары суусундагы IPA деңгээли менен байланышкан митохондриялык транскрипттер үчүн биз апоптозго (FDR = 0.00001), митофагияга (FDR = 0.00029) жана TNF сигнал берүү жолдоруна (FDR = 0.000006) көңүл бурдук (1A сүрөт, 2-таблица жана 1A-B кошумча сүрөттөр).
Адам боорундагы глобалдык, митохондрия менен байланышкан транскрипттердин жана ДНК метилденишинин кан сары суусундагы IPA деңгээли менен байланышкан кайталануучу анализи. А 268 глобалдык транскриптти, 119 митохондрия менен байланышкан транскрипттерди жана ДНК метилденген транскрипттерди билдирет, алар кан сары суусундагы IPA деңгээли менен байланышкан 3092 CpG сайттарына чагылдырылган (глобалдык транскрипттер жана метилденген ДНК үчүн p маанилери < 0,01 жана митохондриялык транскрипттер үчүн p маанилери < 0,05). Негизги кайталануучу транскрипттер ортодо көрсөтүлгөн (AKT1 жана YKT6). B Эң жогорку өз ара аракеттенүү упайы (0,900) бар 13 гендин башка гендер менен өз ара аракеттенүү картасы StringDB онлайн куралын колдонуу менен кан сары суусундагы IPA деңгээли менен олуттуу байланышкан 56 кайталануучу гендерден (кара сызык аймагы) түзүлгөн. Жашыл: Ген онтологиясынын (GO) клеткалык компонентине: митохондрияга (GO:0005739) чагылдырылган гендер. AKT1 - маалыматтарга (тексттик издөө, эксперименттер, маалымат базалары жана биргелешип экспрессиялоо) негизделген башка белоктор менен өз ара аракеттенүү боюнча эң жогорку баллга (0,900) ээ болгон белок. Тармак түйүндөрү белокторду, ал эми четтери белоктордун ортосундагы байланыштарды билдирет.
Ичеги микробиотасы метаболиттери ДНК метилденүүсү аркылуу эпигенетикалык курамды жөнгө сала алгандыктан [32], биз кан сары суусундагы IPA деңгээли боордун ДНК метилденүүсү менен байланыштуубу же жокпу, изилдедик. Кан сары суусундагы IPA деңгээли менен байланышкан эки негизги метилденүү орду пролинге бай 3-аймакка (C19orf55) жана жылуулук шок протеини B үй-бүлөсүнүн (кичинекей) мүчөсү 6га (HSPB6) жакын экенин аныктадык (кошумча файл 3). 4350 CpG ДНК метилденүүсү (p < 0,01) кан сары суусундагы IPA деңгээли менен корреляцияланган жана узак жашоону жөнгө салуучу жолдор менен байытылган (p = 0,006) (1A-сүрөт, 2-таблица жана кошумча 1C-сүрөт).
Адам боорундагы сывороткадагы IPA деңгээли, глобалдык транскрипттер, митохондрия менен байланышкан транскрипттер жана ДНК метилденүүсүнүн ортосундагы байланыштардын негизинде жаткан биологиялык механизмдерди түшүнүү үчүн, биз мурунку жол анализинде аныкталган гендердин кабатташуу анализин жүргүздүк (1A-сүрөт). 56 кабатташкан гендин жолду байытуу анализинин жыйынтыктары (1A-сүрөттөгү кара сызыктын ичинде) апоптоз жолу (p = 0.00029) үч анализге жалпы болгон эки генди бөлүп көрсөткөнүн көрсөттү: Венн диаграммасында көрсөтүлгөндөй (2-кошумча сүрөт жана 1A-сүрөт). Кызыктуусу, биз AKT1 (cg19831386) жана YKT6 (cg24161647) сывороткадагы IPA деңгээли менен оң корреляцияланганын аныктадык (3-кошумча файл). Ген продуктуларынын ортосундагы потенциалдуу белок өз ара аракеттенүүсүн аныктоо үчүн, биз кириш сөз катары 56 кабатташкан гендердин арасынан эң жогорку жалпы аймактык упайга (0.900) ээ болгон 13 генди тандап алдык жана өз ара аракеттенүү картасын түздүк. Ишеним деңгээлине (чектик ишеним) ылайык, эң жогорку баллга (0,900) ээ болгон AKT1 гени эң жогорку орунда болгон (1B-сүрөт).
Жолду талдоо негизинде, биз апоптоз негизги жол экенин аныктадык, ошондуктан IPA менен дарылоо HSCлердин апоптозуна in vitro таасир этеби же жокпу, изилдедик. Биз мурда IPAнын ар кандай дозалары (10 мкМ, 100 мкМ жана 1 мМ) LX-2 клеткалары үчүн уулуу эмес экенин көрсөттүк [15]. Бул изилдөө IPA менен дарылоо 10 мкМ жана 100 мкМде жашоого жөндөмдүү жана некрозго учураган клеткалардын санын көбөйткөнүн көрсөттү. Бирок, контролдук топ менен салыштырганда, клетканын жашоого жөндөмдүүлүгү 1 мМ IPA концентрациясында төмөндөгөн, ал эми клетка некрозунун ылдамдыгы өзгөрүүсүз калган (2А, В сүрөттөрү). Андан кийин, LX-2 клеткаларында апоптозду индукциялоо үчүн оптималдуу концентрацияны табуу үчүн, биз 24 саат бою 10 мкМ, 100 мкМ жана 1 мМ IPAны сынап көрдүк (2А-Е сүрөттөрү жана кошумча 3А-В сүрөттөрү). Кызыктуусу, IPA 10 μM жана 100 μM апоптоз көрсөткүчүн (%) төмөндөткөн, бирок IPA 1 mM контролдук топко салыштырмалуу кеч апоптозду жана апоптоз көрсөткүчүн (%) жогорулаткан жана ошондуктан андан аркы эксперименттер үчүн тандалып алынган (2A–D сүрөттөрү).
IPA LX-2 клеткаларынын апоптозун индукциялайт. Апоптоз ылдамдыгын жана клетка морфологиясын агым цитометриясы аркылуу сандык жактан аныктоо үчүн Annexin V жана 7-AAD кош боёо ыкмасы колдонулган. BA клеткалары 24 саат бою 10 мкМ, 100 мкМ жана 1 мМ IPA менен же F–H TGF-β1 (5 нг/мл) жана 1 мМ IPA менен кан сары суусуз чөйрөдө 24 саат бою инкубацияланган. A: тирүү клеткалар (Annexin V -/ 7AAD-); B: некроздук клеткалар (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: эрте (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: кеч (Annexin V+/7AAD.+); E, H: апоптоз ылдамдыгындагы эрте жана кеч апоптоздук клеткалардын жалпы пайызы (%). Маалыматтар орточо ± SD катары көрсөтүлөт, n = 3 көз карандысыз эксперименттер. Статистикалык салыштыруулар бир тараптуу ANOVA жана Бонферрони пост-хок тести аркылуу жүргүзүлдү. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Буга чейин көрсөткөндөй, 5 нг/мл TGF-β1 классикалык маркер гендеринин экспрессиясын жогорулатуу менен HSC активациясын индукциялай алат [15]. LX-2 клеткалары 5 нг/мл TGF-β1 жана 1 мМ IPA менен айкалыштырылган (2E–H сүрөт). TGF-β1 менен дарылоо апоптоз ылдамдыгын өзгөрткөн жок, бирок IPA менен бирге дарылоо TGF-β1 менен дарылоого салыштырмалуу кеч апоптозду жана апоптоз ылдамдыгын (%) жогорулатты (2E–H сүрөт). Бул жыйынтыктар 1 мМ IPA TGF-β1 индукциясынан көз карандысыз LX-2 клеткаларында апоптозду күчөтө аларын көрсөтүп турат.
Биз LX-2 клеткаларындагы митохондриялык дем алууга IPAнын таасирин андан ары изилдедик. Жыйынтыктар көрсөткөндөй, 1 мМ IPA кычкылтек керектөө ылдамдыгынын (OCR) параметрлерин төмөндөткөн: митохондриялык эмес дем алуу, базалдык жана максималдуу дем алуу, протондун агып чыгышы жана АТФ өндүрүшү контролдук топко салыштырмалуу (3A, B сүрөт), ал эми биоэнергетикалык ден соолук индекси (BHI) өзгөргөн жок.
IPA LX-2 клеткаларында митохондриялык дем алууну азайтат. Митохондриялык дем алуу ийри сызыгы (OCR) митохондриялык дем алуу параметрлери (митохондриялык эмес дем алуу, базалдык дем алуу, максималдуу дем алуу, протондун агып кетиши, АТФтин пайда болушу, SRC жана BHI) катары көрсөтүлөт. А жана В клеткалары тиешелүүлүгүнө жараша 10 мкМ, 100 мкМ жана 1 мМ IPA менен 24 саат бою инкубацияланган. С жана D клеткалары тиешелүүлүгүнө жараша сывороткасыз чөйрөдө TGF-β1 (5 нг/мл) жана 1 мМ IPA менен 24 саат бою инкубацияланган. Бардык өлчөөлөр CyQuant комплектин колдонуу менен ДНКнын курамына нормалдаштырылган. BHI: биоэнергетикалык ден соолук индекси; SRC: дем алуу резервдик сыйымдуулугу; OCR: кычкылтек керектөө ылдамдыгы. Маалыматтар орточо ± стандарттык четтөө (SD), n = 5 көз карандысыз эксперимент катары көрсөтүлгөн. Статистикалык салыштыруулар бир тараптуу ANOVA жана Bonferroni пост-hoc тести аркылуу жүргүзүлдү. *p < 0,05; **p < 0,01; жана ***p < 0,001
IPAнын TGF-β1 менен активдештирилген LX-2 клеткаларынын биоэнергетикалык профилине тийгизген таасирин кеңири түшүнүү үчүн, биз OCR аркылуу митохондриялык кычкылдандыруучу фосфорлошууну талдап чыктык (3C, D сүрөт). Жыйынтыктар көрсөткөндөй, TGF-β1 менен дарылоо максималдуу дем алууну, дем алуунун резервдик сыйымдуулугун (SRC) жана BHIди контролдук топко салыштырмалуу азайтышы мүмкүн (3C, D сүрөт). Мындан тышкары, айкалышкан дарылоо базалдык дем алууну, протондун агып чыгышын жана АТФ өндүрүшүн төмөндөткөн, бирок SRC жана BHI TGF-β1 менен дарылангандарга караганда бир кыйла жогору болгон (3C, D сүрөт).
Ошондой эле, биз Seahorse программасы тарабынан берилген "Клеткалык энергия фенотип тестин" жүргүздүк (4A–D кошумча сүрөтү). 3B кошумча сүрөтүндө көрсөтүлгөндөй, TGF-β1 дарылоодон кийин OCR жана ECAR метаболикалык потенциалдары төмөндөгөн, бирок, контролдук топко салыштырмалуу айкалышкан жана IPA дарылоо топторунда эч кандай айырмачылык байкалган эмес. Андан тышкары, айкалышкан жана IPA дарылоодон кийин контролдук топко салыштырмалуу OCRдин базалдык жана стресстик деңгээлдери төмөндөгөн (4C кошумча сүрөтү). Кызыктуусу, ушул сыяктуу схема айкалышкан терапияда байкалган, мында TGF-β1 дарылоого салыштырмалуу ECARдын базалдык жана стресстик деңгээлдеринде эч кандай өзгөрүү байкалган эмес (4C кошумча сүрөтү). HSCлерде митохондриялык кычкылдануу фосфорлануусунун төмөндөшү жана айкалышкан дарылоонун TGF-β1 дарылоосуна дуушар болгондон кийин SCR жана BHIди калыбына келтирүү жөндөмү метаболикалык потенциалды өзгөрткөн эмес (OCR жана ECAR). Бул жыйынтыктар чогуу алганда, IPA HSCлердеги биоэнергетиканы төмөндөтүшү мүмкүн экенин көрсөтүп турат, бул IPA HSC фенотипин инактивдештирүүгө карай жылдырган төмөнкү энергетикалык профилди пайда кылышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат (Кошумча 4D-сүрөт).
IPAнын митохондриялык динамикага тийгизген таасири митохондриялык морфологиянын жана тармактык байланыштардын үч өлчөмдүү сандык аныктоосу, ошондой эле MTR боёгу аркылуу изилденген (4-сүрөт жана 5-кошумча сүрөт). 4-сүрөттө контролдук топко салыштырмалуу TGF-β1 менен дарылоо орточо беттик аянтты, бутактардын санын, бутактын жалпы узундугун жана бутактын түйүн санын азайтканы (4A жана B сүрөттөрү) жана митохондриялардын үлүшүн сфералыктан ортоңку морфологияга өзгөрткөнү көрсөтүлгөн (4C сүрөтү). IPA менен дарылоо гана митохондриянын орточо көлөмүн азайтып, контролдук топко салыштырмалуу митохондриянын үлүшүн сфералыктан ортоңку морфологияга өзгөрткөн (4A сүрөтү). Ал эми митохондриялык мембрананын потенциалына көз каранды MTR менен бааланган сфералык, бутактын орточо узундугу жана митохондриялык активдүүлүк (4A жана E сүрөттөрү) өзгөрүүсүз калган жана бул параметрлер топтордун ортосунда айырмаланган эмес. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар TGF-β1 жана IPA менен дарылоо тирүү LX-2 клеткаларында митохондриянын формасын жана өлчөмүн, ошондой эле тармактын татаалдыгын модуляциялай тургандай көрүнөт деп божомолдоого болот.
IPA LX-2 клеткаларындагы митохондриялык динамиканы жана митохондриялык ДНКнын молчулугун өзгөртөт. A. TGF-β1 (5 нг/мл) жана 1 мМ IPA менен 24 саат бою сывороткасыз чөйрөдө инкубацияланган тирүү LX-2 клеткаларынын репрезентативдик конфокалдык сүрөттөрү, анда Mitotracker™ Red CMXRos менен боёлгон митохондриялык тармактар ​​жана DAPI менен көк түскө боёлгон ядролор көрсөтүлгөн. Бардык маалыматтар ар бир топко кеминде 15 сүрөттү камтыган. Ар бир үлгү түрү үчүн биз 10 Z-стек сүрөтүн алдык. Ар бир Z-огунун ырааттуулугу 30 кесинди камтыган, ар биринин калыңдыгы 9,86 мкм. Масштаб тилкеси: 10 мкм. B. Сүрөткө адаптациялык босогону колдонуу менен аныкталган репрезентативдик объектилер (митохондриялар гана). Ар бир топтун бардык клеткалары үчүн митохондриялык морфологиялык тармактык байланыштарды сандык талдоо жана салыштыруу жүргүзүлдү. C. Митохондриялык форма катыштарынын жыштыгы. 0гө жакын маанилер тоголок формаларды, ал эми 1ге жакын маанилер жипче сымал формаларды көрсөтөт. D Митохондриялык ДНКнын (мтДНК) курамы "Материалдар жана методдор" бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй аныкталган. E Mitotracker™ Red CMXRos анализи "Материалдар жана методдор" бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй агым цитометриясы (30 000 окуя) аркылуу жүргүзүлдү. Маалыматтар орточо ± SD, n = 3 көз карандысыз эксперимент катары берилген. Статистикалык салыштыруулар бир тараптуу ANOVA жана Bonferroni post hoc тести аркылуу жүргүзүлдү. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Андан кийин биз LX-2 клеткаларындагы мтДНКнын курамын митохондриялык сандын индикатору катары талдадык. Контролдук топ менен салыштырганда, TGF-β1 менен дарыланган топто мтДНКнын курамы жогорулаган (4D-сүрөт). TGF-β1 менен дарыланган топ менен салыштырганда, айкалышкан дарылоо тобунда мтДНКнын курамы төмөндөгөн (4D-сүрөт), бул IPA мтДНКнын курамын жана, балким, митохондриялык санын, ошондой эле митохондриялык дем алууну азайтышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат (3C-сүрөт). Андан тышкары, IPA айкалышкан дарылоодо мтДНКнын курамын азайткандай көрүнгөн, бирок MTR аркылуу митохондриялык активдүүлүккө таасир эткен эмес (4A–C-сүрөттөр).
Биз IPAнын LX-2 клеткаларындагы фиброз, апоптоз, жашоо жана митохондриялык динамика менен байланышкан гендердин мРНК деңгээли менен байланышын изилдедик (5A–D сүрөт). Контролдук топ менен салыштырганда, TGF-β1 менен дарыланган топ I типтеги коллаген α2 чынжыры (COL1A2), α-жылмакай булчуң актини (αSMA), матрицалык металлопротеиназа 2 (MMP2), металлопротеиназа 1дин ткандык ингибитору (TIMP1) жана динамин 1 сыяктуу ген (DRP1) сыяктуу гендердин экспрессиясынын жогорулаганын көрсөттү, бул фиброздун жана активациянын жогорулаганын көрсөтүп турат. Андан тышкары, контролдук топ менен салыштырганда, TGF-β1 менен дарылоо ядролук прегнан X рецепторунун (PXR), каспаза 8дин (CASP8), MAPKAPK3тин, В-клетка α ингибиторунун, ядролук фактор κ генинин жарык пептидинин (NFκB1A) күчөткүчүнүн жана ядролук фактор κB киназа суббирдигинин β ингибиторунун (IKBKB) мРНК деңгээлин төмөндөттү (5A–D сүрөт). TGF-β1 дарылоосу менен салыштырганда, TGF-β1 жана IPA менен айкалышкан дарылоо COL1A2 жана MMP2 экспрессиясын төмөндөткөн, бирок PXR, TIMP1, В-клеткалык лимфома-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β жана IKBKB мРНК деңгээлин жогорулаткан. IPA дарылоосу MMP2, Bcl-2 менен байланышкан X белок (BAX), AKT1, оптикалык атрофия белогу 1 (OPA1) жана митохондриялык биригүү белогу 2 (MFN2) экспрессиясын бир кыйла төмөндөткөн, ал эми CASP8, NFκB1A, NFκB1B жана IKBKB экспрессиясы контролдук топко салыштырмалуу жогорулаган. Бирок, каспаза-3 (CASP3), апоптотикалык пептидазаны активдештирүүчү фактор 1 (APAF1), митохондриялык биригүү белогу 1 (MFN1) жана бөлүнүү белогу 1 (FIS1) экспрессиясында эч кандай айырмачылыктар табылган жок. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар IPA дарылоо фиброз, апоптоз, жашоо жана митохондриялык динамика менен байланышкан гендердин экспрессиясын модуляциялай турганын көрсөтүп турат. Биздин маалыматтар IPA дарылоо LX-2 клеткаларындагы фиброзду азайтаарын көрсөтүп турат; ошол эле учурда, ал фенотипти инактивацияга жылдыруу менен жашоону стимулдайт.
IPA LX-2 клеткаларындагы фибробласт, апоптоз, жашоого жөндөмдүүлүк жана митохондриялык динамикалык гендердин экспрессиясын модуляциялайт. Гистограммалар LX-2 клеткалары TGF-β1 жана IPA менен 24 саат бою кан сары суусуз чөйрөдө индукциялангандан кийин эндогендик контролго (RPLP0 же PPIA) салыштырмалуу мРНК экспрессиясын көрсөтөт. А фибробласттарды, В апоптоздук клеткаларды, С тирүү клеткаларды жана D митохондриялык динамикалык гендин экспрессиясын көрсөтөт. Маалыматтар орточо ± стандарттык четтөө (SD) катары берилген, n = 3 көз карандысыз эксперименттер. Статистикалык салыштыруулар бир тараптуу ANOVA жана Bonferroni post hoc тести аркылуу жүргүзүлдү. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Андан кийин, клетканын өлчөмүнүн (FSC-H) жана цитоплазмалык татаалдыктын (SSC-H) өзгөрүшү агым цитометриясы менен бааланган (6A, B сүрөт), ал эми IPA менен дарылоодон кийинки клетка морфологиясынын өзгөрүшү трансмиссиялык электрондук микроскопия (TEM) жана фазалык контрасттык микроскопия (6A-B кошумча сүрөт) менен бааланган. Күтүлгөндөй, TGF-β1 менен дарыланган топтун клеткалары контролдук топко салыштырмалуу өлчөмү боюнча чоңойгон (6A, B сүрөт), бул одоно эндоплазмалык торчо (ER*) жана фаголизосомалардын (P) классикалык кеңейишин көрсөтүп, гемопоэтикалык өзөк клеткаларынын (HSC) активдешүүсүн көрсөтүп турат (6A кошумча сүрөт). Бирок, TGF-β1 менен дарыланган топко салыштырмалуу, TGF-β1 жана IPA айкалышкан дарылоо тобунда клетканын өлчөмү, цитоплазмалык татаалдыгы (6A, B сүрөт) жана ER* курамы азайган (6A кошумча сүрөт). Мындан тышкары, IPA менен дарылоо контролдук топко салыштырмалуу клетканын өлчөмүн, цитоплазманын татаалдыгын (6A, B сүрөттөрү), P жана ER* курамын (кошумча 6A сүрөтү) төмөндөткөн. Мындан тышкары, апоптоздук клеткалардын курамы контролдук топко салыштырмалуу IPA менен дарылоодон 24 саат өткөндөн кийин көбөйгөн (ак жебелер, Кошумча 6B сүрөт). Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар 1 мМ IPA HSC апоптозун стимулдай аларын жана TGF-β1 тарабынан индукцияланган клетканын морфологиялык параметрлериндеги өзгөрүүлөрдү кайтарып, ошону менен клетканын өлчөмүн жана татаалдыгын жөнгө сала аларын көрсөтүп турат, бул HSC инактивациясы менен байланыштуу болушу мүмкүн.
IPA LX-2 клеткаларындагы клетканын өлчөмүн жана цитоплазмалык татаалдыгын өзгөртөт. Агым цитометриясын анализдөөнүн типтүү сүрөттөрү. Анализде LX-2 клеткаларына мүнөздүү болгон дарбаза стратегиясы колдонулган: клетка популяциясын аныктоо үчүн SSC-A/FSC-A, дублеттерди аныктоо үчүн FSC-H/FSC-A жана клетканын өлчөмүн жана татаалдыгын анализдөө үчүн SSC-H/FSC-H. Клеткалар TGF-β1 (5 нг/мл) жана 1 мМ IPA менен сывороткасыз чөйрөдө 24 саат бою инкубацияланган. LX-2 клеткалары клетканын өлчөмүн жана цитоплазмалык татаалдыгын анализдөө үчүн төмөнкү сол квадрантка (SSC-H-/FSC-H-), жогорку сол квадрантка (SSC-H+/FSC-H-), төмөнкү оң квадрантка (SSC-H-/FSC-H+) жана жогорку оң квадрантка (SSC-H+/FSC-H+) бөлүштүрүлгөн. B. Клетканын морфологиясы FSC-H (алдыга чачыратуу, клетканын өлчөмү) жана SSC-H (каптал чачыратуу, цитоплазмалык татаалдык) (30 000 окуя) колдонуу менен агым цитометриясы аркылуу талданган. Маалыматтар орточо ± SD, n = 3 көз карандысыз эксперимент катары берилген. Статистикалык салыштыруулар бир тараптуу ANOVA жана Bonferroni post hoc тести аркылуу жүргүзүлдү. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 жана ****p < 0.0001
ИПА сыяктуу ичеги метаболиттери изилдөөнүн кызуу темасына айланды, бул ичеги микробиотасында жаңы буталарды табууга болорун көрсөтүп турат. Ошондуктан, биз адамдарда боор фиброзу менен байланыштырган метаболит болгон IPA [15] жаныбарлардын моделдеринде потенциалдуу антифибротикалык кошулма экени көрсөтүлгөнү кызыктуу [13, 14]. Бул жерде биз биринчи жолу 2-типтеги диабет (T2D) жок семиз адамдарда сары суудагы IPA менен глобалдык боор транскриптомиясы жана ДНК метилденүүсүнүн ортосундагы байланышты көрсөтүп, апоптозду, митофагияны жана узак жашоону, ошондой эле боор гомеостазын жөнгө салуучу AKT1 генинин мүмкүн болгон кандидатын баса белгилейбиз. Биздин изилдөөнүн дагы бир жаңылыгы, биз IPA дарылоонун апоптоз, клетка морфологиясы, митохондриялык биоэнергетика жана LX-2 клеткаларындагы динамикасы менен өз ара аракеттенишин көрсөттүк, бул HSC фенотипин инактивацияга жылдырган төмөнкү энергия спектрин көрсөтүп, IPAны боор фиброзун жакшыртуу үчүн потенциалдуу талапкерге айландырды.
Биз апоптоз, митофагия жана узак жашоо кан айлануудагы IPA менен байланышкан боор гендеринде байытылган эң маанилүү канондук жолдор экенин аныктадык. Митохондриялык сапатты көзөмөлдөө (MQC) системасынын бузулушу митохондриялык дисфункцияга, митофагияга жана апоптозго алып келип, ошону менен MASLDдин пайда болушуна өбөлгө түзүшү мүмкүн [33, 34]. Ошондуктан, IPA боордо апоптоз, митофагия жана узак жашоо аркылуу клетка динамикасын жана митохондриялык бүтүндүктү сактоого катышышы мүмкүн деп божомолдой алабыз. Биздин маалыматтар үч анализде эки гендин жалпы экендигин көрсөттү: YKT6 жана AKT1. Белгилей кетүүчү нерсе, YKT6 - бул клетка мембранасынын биригүү процессине катышкан SNARE белогу. Ал аутофагосомада STX17 жана SNAP29 менен инициациялык комплексти түзүү менен аутофагияда жана митофагияда роль ойнойт, ошону менен аутофагосомалардын жана лизосомалардын биригишине өбөлгө түзөт [35]. Андан тышкары, YKT6 функциясынын жоголушу митофагиянын бузулушуна алып келет [36], ал эми YKT6нын жогорулашы боор клеткалык карциномасынын (БКК) өнүгүшү менен байланыштуу болуп, клеткалардын жашоо деңгээлинин жогорулаганын көрсөтөт [37]. Башка жагынан алганда, AKT1 эң маанилүү өз ара аракеттенүүчү ген болуп саналат жана PI3K/AKT сигнал берүү жолу, клетка цикли, клеткалардын миграциясы, пролиферациясы, фокалдык адгезиясы, митохондриялык функция жана коллагендин бөлүнүп чыгышы сыяктуу боор ооруларында маанилүү ролду ойнойт [38–40]. Активдештирилген PI3K/AKT сигнал берүү жолу клеткадан тышкаркы матрицаны (ЭКМ) өндүрүү үчүн жооптуу клеткалар болгон гемопоэтикалык өзөк клеткаларын (ГӨК) активдештире алат жана анын дисрегуляциясы боор фиброзунун пайда болушуна жана өнүгүшүнө өбөлгө түзүшү мүмкүн [40]. Мындан тышкары, AKT p53-көз каранды клетка апоптозун басуучу клеткалардын жашоо деңгээлинин негизги факторлорунун бири болуп саналат жана AKT активдешүүсү боор клеткаларынын апоптозунун басылышы менен байланыштуу болушу мүмкүн [41, 42]. Алынган жыйынтыктар IPA апоптозго кирүү же жашоо ортосундагы гепатоциттердин чечимине таасир этүү менен боордун митохондриясына байланыштуу апоптозго катышышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Бул таасирлер боордун гомеостазы үчүн маанилүү болгон AKT жана/же YKT6 талапкер гендери менен жөнгө салынышы мүмкүн.
Биздин жыйынтыктар көрсөткөндөй, 1 мМ IPA TGF-β1 дарылоосунан көз карандысыз LX-2 клеткаларында апоптозду пайда кылып, митохондриялык дем алууну төмөндөткөн. Белгилей кетчү нерсе, апоптоз фиброзду жоюунун жана гемопоэтикалык өзөк клеткаларынын (HSC) активдешүүсүнүн негизги жолу болуп саналат жана ошондой эле боор фиброзунун кайтарымдуу физиологиялык реакциясындагы негизги окуя болуп саналат [4, 43]. Андан тышкары, LX-2 клеткаларында BHIдин айкалышкан дарылоодон кийин калыбына келиши митохондриялык биоэнергетиканы жөнгө салуудагы IPAнын потенциалдуу ролу жөнүндө жаңы түшүнүктөрдү берди. Тынч жана активдүү эмес шарттарда гемопоэтикалык клеткалар адатта АТФ өндүрүү үчүн митохондриялык кычкылдануу фосфорлануусун колдонушат жана зат алмашуу активдүүлүгү төмөн болот. Башка жагынан алганда, HSC активдешүүсү гликолитикалык абалга кирүүнүн энергия муктаждыктарын компенсациялоо үчүн митохондриялык дем алууну жана биосинтезди күчөтөт [44]. IPA зат алмашуу потенциалына жана ECARга таасир этпегендиги гликолитикалык жолдун анчалык артыкчылыктуу эместигин көрсөтүп турат. Ошо сыяктуу эле, дагы бир изилдөө 1 мМ IPA кардиомиоциттердеги, адамдын гепатоцит клетка линиясындагы (Huh7) жана адамдын киндик венасынын эндотелий клеткаларындагы (HUVEC) митохондриялык дем алуу чынжырынын активдүүлүгүн модуляциялай алганын көрсөттү; Бирок, IPAнын кардиомиоциттердеги гликолизге эч кандай таасири табылган жок, бул IPA башка клетка түрлөрүнүн биоэнергетикасына таасир этиши мүмкүн дегенди билдирет [45]. Ошондуктан, биз 1 мМ IPA жумшак химиялык ажыратуучу катары иштеши мүмкүн деп божомолдойбуз, анткени ал фиброгендик ген экспрессиясын, клетка морфологиясын жана митохондриялык биоэнергетиканы mtДНКнын көлөмүн өзгөртпөстөн бир топ төмөндөтө алат [46]. Митохондриялык ажыратуучулар культурадан индукцияланган фиброзду жана HSC активациясын ингибирлей алат [47] жана ажыратуучу белоктор (UCP) же аденин нуклеотиддик транслоказа (ANT) сыяктуу айрым белоктор тарабынан жөнгө салынуучу же индукцияланган митохондриялык АТФ өндүрүшүн азайта алат. Клетканын түрүнө жараша, бул кубулуш клеткаларды апоптоздон коргойт жана/же апоптозду күчөтөт [46]. Бирок, IPAнын гемопоэтикалык өзөк клеткаларын инактивдештирүүдө митохондриялык ажыратуучу катары ролун аныктоо үчүн андан ары изилдөөлөр талап кылынат.
Андан кийин биз митохондриялык дем алуунун өзгөрүшү тирүү LX-2 клеткаларындагы митохондриялык морфологияга чагылдырылганбы же жокпу, изилдедик. Кызыктуусу, TGF-β1 менен дарылоо митохондриялык пропорцияны сфералыктан ортоңкуга өзгөртөт, митохондриялык бутактануунун төмөндөшү жана митохондриялык бөлүнүүнүн негизги фактору болгон DRP1 экспрессиясынын жогорулашы менен коштолот [48]. Андан тышкары, митохондриялык фрагментация жалпы тармактын татаалдыгы менен байланыштуу жана биригүүдөн бөлүнүүгө өтүү гемопоэтикалык өзөк клеткаларынын (HSC) активдешүүсү үчүн абдан маанилүү, ал эми митохондриялык бөлүнүүнү басаңдатуу HSC апоптозуна алып келет [49]. Ошентип, биздин жыйынтыктар TGF-β1 менен дарылоо бутактануунун төмөндөшү менен митохондриялык тармактын татаалдыгынын төмөндөшүнө алып келиши мүмкүн экенин көрсөтүп турат, бул активдештирилген гемопоэтикалык өзөк клеткалары (HSC) менен байланышкан митохондриялык бөлүнүүдө көбүрөөк кездешет. Андан тышкары, биздин маалыматтар IPA митохондриянын пропорциясын сфералыктан ортоңку формага өзгөртө аларын, ошону менен OPA1 жана MFN2 экспрессиясын азайта аларын көрсөттү. Изилдөөлөр OPA1дин төмөндөшү митохондриялык мембрана потенциалынын төмөндөшүнө алып келип, клетканын апоптозун козгошу мүмкүн экенин көрсөттү [50]. MFN2 митохондриялык биригүүнү жана апоптозду жөнгө салуучу экени белгилүү [51]. Алынган жыйынтыктар TGF-β1 жана/же IPA тарабынан LX-2 клеткаларынын индукциясы митохондриянын формасын жана өлчөмүн, ошондой эле активация абалын жана тармактын татаалдыгын модуляциялай тургандыгын көрсөтүп турат.
Биздин жыйынтыктар TGFβ-1 жана IPA менен айкалышкан дарылоо апоптоздон качкан клеткалардагы фиброздун, апоптоздун жана жашоого байланыштуу гендердин мРНК экспрессиясын жөнгө салуу менен мтДНКны жана клетканын морфологиялык параметрлерин азайта аларын көрсөтүп турат. Чынында эле, IPA AKT1 жана COL1A2 жана MMP2 сыяктуу маанилүү фиброз гендеринин мРНК экспрессиясынын деңгээлин төмөндөткөн, бирок апоптоз менен байланышкан CASP8 экспрессиясынын деңгээлин жогорулаткан. Биздин жыйынтыктар IPA менен дарылоодон кийин BAX экспрессиясы төмөндөп, TIMP1 үй-бүлө суббирдиктеринин, BCL-2 жана NF-κB мРНК экспрессиясы жогорулаганын көрсөттү, бул IPA апоптоздон качкан гемопоэтикалык өзөк клеткаларында (HSC) жашоо сигналдарын стимулдай аларын көрсөтүп турат. Бул молекулалар активдештирилген гемопоэтикалык өзөк клеткаларында жашоону колдоочу сигналдар катары иштеши мүмкүн, бул антиапоптоздук белоктордун (мисалы, Bcl-2) экспрессиясынын жогорулашы, проапоптоздук BAX экспрессиясынын төмөндөшү жана TIMP менен NF-κB ортосундагы татаал өз ара аракеттенүү менен байланыштуу болушу мүмкүн [5, 7]. IPA өз таасирин PXR аркылуу көрсөтөт жана биз TGF-β1 жана IPA менен айкалышкан дарылоо PXR мРНК экспрессиясынын деңгээлин жогорулаткандыгын аныктадык, бул HSC активациясынын басылышын көрсөтөт. Активдештирилген PXR сигнализациясы HSC активациясын in vivo жана in vitro шарттарында ингибирлей турганы белгилүү [52, 53]. Биздин жыйынтыктар IPA апоптозду күчөтүү, фиброзду жана митохондриялык метаболизмди азайтуу жана жашоо сигналдарын күчөтүү аркылуу активдештирилген HSCлерди тазалоого катыша аларын көрсөтүп турат, бул активдештирилген HSC фенотипин инактивдештирилгенге айландыруучу типтүү процесстер. Апоптоздогу IPAнын потенциалдуу механизминин жана ролунун дагы бир мүмкүн болгон түшүндүрмөсү, ал дисфункционалдык митохондрияларды негизинен митофагия (ички жол) жана NF-κB жашоо сигнал берүү жолу менен түздөн-түз байланышкан тышкы TNF сигнал берүү жолу (1-таблица) аркылуу тазалайт (кошумча 7-сүрөт). Кызыктуусу, IPA менен байланышкан байытылган гендер апоптоздук жолдо проапоптоздук жана про-жашоо сигналдарын индукциялай алат [54], бул IPA бул гендер менен өз ара аракеттенүү аркылуу апоптоздук жолду же жашоону индукциялашы мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Бирок, IPA HSC активациясы учурунда апоптозду же жашоону кантип индукциялайт жана анын механикалык жолдору белгисиз бойдон калууда.
IPA - бул ичеги микробиотасы аркылуу тамак-аш менен алынган триптофандан пайда болгон микробдук метаболит. Изилдөөлөр көрсөткөндөй, ал ичеги чөйрөсүндө сезгенүүгө каршы, антиоксиданттык жана эпигенетикалык жөнгө салуучу касиеттерге ээ.[55] Изилдөөлөр IPA ичегинин тосмо функциясын модуляциялап, кычкылдануу стрессин азайта аларын, бул анын жергиликтүү физиологиялык таасирине салым кошо аларын көрсөттү.[56] Чындыгында, IPA кан айлануу аркылуу максаттуу органдарга жеткирилет жана IPA триптофан, серотонин жана индол туундулары менен окшош негизги метаболиттик түзүлүшкө ээ болгондуктан, IPA атаандаштыкка алып келүүчү метаболикалык аракеттерди жасайт.[52] IPA ферменттерге же рецепторлорго байланышуу жерлери үчүн триптофандан алынган метаболиттер менен атаандашып, кадимки метаболизм жолдорун бузушу мүмкүн. Бул анын терапиялык терезесин жакшыраак түшүнүү үчүн анын фармакокинетикасы жана фармакодинамикасы боюнча андан ары изилдөө жүргүзүү зарылдыгын баса белгилейт.[57] Бул гемопоэтикалык өзөк клеткаларында (HSCs) да болушу мүмкүнбү же жокпу, азырынча белгисиз.
Биздин изилдөөбүздүн айрым чектөөлөрү бар экенин моюнга алабыз. IPA менен байланышкан байланыштарды атайын изилдөө үчүн, биз 2-типтеги кант диабети (2-типтеги кант диабети) менен ооругандарды кошкон жокпуз. Бул биздин жыйынтыктарыбыздын 2-типтеги кант диабети жана боор оорусунун өнүккөн түрү менен ооругандарга кеңири колдонулушун чектей турганын моюнга алабыз. Адамдын кан сары суусундагы IPAнын физиологиялык концентрациясы 1–10 мкМ болгону менен [11, 20], 1 мМ IPA концентрациясы эң жогорку уулуу эмес концентрацияга [15] жана апоптоздун эң жогорку ылдамдыгына негизделип тандалып алынган, некроздук клеткалардын популяциясынын пайызында эч кандай айырмачылык болгон эмес. Бул изилдөөдө IPAнын супрафизиологиялык деңгээлдери колдонулганы менен, учурда IPAнын натыйжалуу дозасы боюнча бирдиктүү пикир жок [52]. Биздин жыйынтыктарыбыз маанилүү болгону менен, IPAнын кеңири метаболикалык тагдыры изилдөөнүн активдүү багыты бойдон калууда. Андан тышкары, кан сары суусундагы IPA деңгээли менен боор транскрипттеринин ДНК метилденишинин ортосундагы байланыш боюнча биздин жыйынтыктарыбыз гемопоэтикалык өзөк клеткаларынан (HSC) гана эмес, боор ткандарынан да алынган. Биз IPA гемопоэтикалык өзөк клеткаларынын (HSC) активдешүүсү менен байланышкан [15] жана HSCлер боор фиброзунун өнүгүшүнө катышкан негизги клеткалар экендиги жөнүндөгү транскриптомдук анализдин мурунку жыйынтыктарына таянып, адамдын LX-2 клеткаларын колдонууну чечтик. Боор бир нече клетка түрлөрүнөн турат, андыктан IPAнын ролун жана анын башка боор клеткаларынын түрлөрү менен өз ара аракеттенүүсүн изилдөө үчүн каспаза активдешүүсү жана ДНКнын фрагментациясы менен айкалышкан гепатоцит-HSC-иммундук клеткалардын биргелешип өстүрүү системасы, ошондой эле белок деңгээлин камтыган аракет механизми сыяктуу башка клетка моделдерин карап чыгуу керек.