Секретордук жолдо белокторду сорттоо клетканын бөлүнүшүн жана гомеостазын сактоо үчүн абдан маанилүү. Кабык аркылуу сорттоодон тышкары, секретордук ташуу процессинде кинезиндерди сорттоодогу липиддердин ролу көптөн бери чечилбей келе жаткан негизги суроо болуп саналат. Бул жерде биз жаңы синтезделген гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизацияланган белоктордун өтө узун керамиддик липиддик бөлүктөрү бар белоктор кластерленгенин жана трансмембраналык белоктор колдонгондон айырмаланган адистештирилген эндоплазманын таза чыгуучу жерине классификацияланганын in vivo далилдөө үчүн 3D бир эле учурда көп түстүү жогорку чечилиштеги реалдуу убакыттагы сүрөткө тартууну жүргүзөбүз. Мындан тышкары, биз эндоплазмалык торчо мембранасындагы керамиддин чынжыр узундугу бул сорттоо селективдүүлүгү үчүн абдан маанилүү экенин көрсөтөбүз. Биздин изилдөө белок жүктөрүн липиддик чынжырдын узундугуна негизделген секретордук жолдо селективдүү экспорттук жерлерге классификациялоонун биринчи түз in vivo далилин берет.
Эукариоттук клеткаларда эндоплазмалык торчодо (ЭР) синтезделген белоктор андан кийин тиешелүү клеткалык көздөгөн жерине жеткирүү үчүн секретордук жол аркылуу ташуу учурунда сорттолот (1). Каптама аркылуу сорттоодон тышкары, айрым липиддер белгилүү бир белокторго тиешелүү мембрана домендерине кластерлөө менен тандалма чыгуу чекиттери катары да кызмат кыла алат деген божомол көптөн бери айтылып келген (2-5). Бирок, бул мүмкүн болгон липидге негизделген механизмди далилдөө үчүн in vivo түз далилдер дагы эле жетишсиз. Бул негизги көйгөйдү чечүү үчүн, биз ачыткыда гликозилфосфатидилинозитол (GPI) менен байланышкан белоктордун (GPI-AP) ЭРден кантип дифференциалдуу түрдө экспорттолгонун изилдедик. GPI-APлар - бул липиддер менен байланышкан клетка бетиндеги белоктордун бир түрү (6, 7). GPI-AP - бул плазма мембранасынын сырткы баракчаларына гликолипид бөлүгү (GPI анкери) аркылуу бекитилген бөлүнүп чыккан белок. Алар ЭР люмениндеги консервативдик посттрансляциялык модификациялар катары ГПИ анкерлерин кабыл алышат (8). Жабышкандан кийин, GPI-AP Гольджи аппараты (5, 9) аркылуу ЭРден плазмалык мембранага өтөт. GPI анкерлеринин болушу GPI-APтин трансмембраналык бөлүнүп чыккан белоктордон (башка плазмалык мембраналык белокторду кошо алганда) секретордук жол боюнча өзүнчө ташылышына алып келет (5, 9, 10). Ачыткы клеткаларында GPI-APтер эндоплазмалык торчодо башка бөлүнүп чыккан белоктордон бөлүнүп, андан кийин кабык белок комплекси II (COPII) менен оролгон уникалдуу везикулаларга таңгакталат (6, 7). ЭР экспорттоо процессиндеги бул классификация процессинин детерминанттары белгисиз, бирок бул механизм липиддерди, айрыкча GPI анкеринин липиддик бөлүгүнүн структуралык кайра түзүлүшүн талап кылышы мүмкүн деп болжолдонууда (5, 8). Ачыткыда GPI липиддик кайра түзүлүшү GPI бекитилгенден кийин дароо башталат жана көп учурларда керамиддин 26-көмүртектүү узун чынжырлуу каныккан май кислотасына (C26:0) байланышуусуна алып келет (11, 12). C26 церамиди ачыткы клеткалары тарабынан азырынча өндүрүлгөн негизги керамид болуп саналат. Ал ERде синтезделет жана анын көпчүлүгү COPII көбүкчөлөрү аркылуу Гольджи аппаратына экспорттолот (13). GPI-APтин ER экспорту үчүн үзгүлтүксүз керамид синтези талап кылынат (14, 15) жана өз кезегинде, Гольджи аппаратында керамидди инозитолфосфат церамидине (IPC) айландыруу GPI анкердик синтезине көз каранды (16). Жасалма мембраналар менен жүргүзүлгөн биофизикалык изилдөөлөр көрсөткөндөй, өтө узун ацил чынжырлуу керамиддер биригип, уникалдуу физикалык касиеттери бар иреттелген домендерди түзө алат (17, 18). Бул маалыматтар C26 церамиди жана C26 церамиди менен GPI-AP өздөрүнүн физикалык касиеттерин колдонуп, салыштырмалуу башаламан ER мембранасынын липиддик чөйрөсүндө иреттелген аймактарга же аймактарга биригет деген гипотезага алып келет. Ал негизинен кыска жана каныкпаган глицеролипиддерден турат (C16:1 жана C18:1) (19, 20). Бул аймактар ​​тандалма түрдө белгилүү бир ER чыгуучу жерлерге (ERES) багытталат, ал жерде керамид жана керамидге негизделген GPI-AP ошол эле атайын COPII везикуласында Гольджиге биргелешип ташылышы мүмкүн (5).
Бул изилдөөдө биз бул липидге негизделген механизмди флуоресценттик түрдө белгиленген белокторду бир эле учурда байкай алган алдыңкы микроскопия ыкмасы болгон супер чечилиштеги конфокалдык реалдуу убакыттагы сүрөт микроскопиясын (SCLIM) колдонуу менен түздөн-түз сынап көрдүк. Үч түстүү жана үч өлчөмдүү (3D) сүрөттөр тирүү клеткаларда өтө жогорку чечилишке жана ылдамдыкка ээ (21, 22).
Биз алгач SCLIM технологиясын колдонуп, S. cerevisiae бактериясындагы ERден чыккандан кийин трансмембраналык бөлүнүп чыккан белоктордон C26 керамид тобу бар кадимки GPI-AP кантип текшерилгенин аныктадык. ERдин классификациясын текшерүү үчүн, биз in vivo ERESке кирген жаңы синтезделген жүктү түздөн-түз визуализациялай алган генетикалык системаны колдондук (7, 23). Жүк катары биз жашыл флуоресценттик белок (GFP) менен белгиленген C26 керамид негизиндеги GPI-AP Gas1 жана жакын инфракызыл флуоресценттик белок (iRFP) менен белгиленген трансмембраналык бөлүнүп чыккан Mid2 белокту тандап алдык, экөө тең плазма мембранасын бутага алат (24–26). sec31-1 температурага сезгич мутантында бул эки жүк галактоза менен индукциялануучу промотор жана конститутивдик ERES маркери астында экспрессияланат. Өтө жогорку температурада (37°C), sec31-1 мутациясы COPII кабык компоненти Sec31дин COPII өнүп чыгышын жана ER экспортун токтотуу функциясына таасир эткендиктен, жаңы синтезделген жүк ERде топтолот (23). Төмөн температурага (24°C) чейин муздагандан кийин, sec31-1 мутант клеткалары секретордук аймактан калыбына келип, топтолгон жаңы синтетикалык жүк ERден экспорттоло баштаган. CLIM визуализациясы көрсөткөндөй, жаңы синтезделген Gas1-GFP жана Mid2-iRFP көпчүлүк бөлүгү 37°Cде инкубациялангандан кийин дагы эле sec31-1 мутант клеткаларынын ERде топтолуп, андан кийин 24°Cде 5 мүнөткө бошотулган (1-сүрөт). Mid2-iRFP бүт ER мембранасында бөлүштүрүлгөндүктөн жана Gas1-GFP үзгүлтүксүз ER мембрана аймагында концентрацияланып, чогултулгандыктан, алардын бөлүштүрүлүшү таптакыр башкача (1-сүрөт, А дан С га чейин жана S1 тасмасы). Мындан тышкары, 1D сүрөттө көрсөтүлгөндөй, Gas1-GFP кластеринде Mid2-iRFP жок. Бул жыйынтыктар GPI-AP жана трансмембраналык белоктор эрте ар кандай ER мембрана аймактарына бөлүнгөнүн көрсөтүп турат. Gas1-GFP кластери mCherry'нин COPII кабык протеини Sec13 менен белгиленген белгилүү бир ERESке жанаша жайгашкан (1-сүрөт, E жана F, жана S1 тасмасы) (23).
sec31-1 клеткалары галактозадан пайда болгон секрецияларды экспрессиялайт, узун ацил чынжыры (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, жашыл) жана трансмембраналык белогу Mid2-iRFP (TMP, көк) жана бул конструктивдүү ERES белгиси Sec13-mCherry (ERES, кызгылтым) 37°C температурада 30 мүнөт инкубацияланып, 24°C температурага жылдырылып, 5 мүнөттөн кийин SCLIM аркылуу сүрөткө тартылган. (Адан Сга чейин) тегиздиктин репрезентативдик бириктирилген же бир өлчөмдүү 2D сүрөтүн (А), 10 z-кесимдин 2D проекциялык сүрөтүн (B) же жүктүн жана ERES маркерлеринин 3D клетка жарым шарынын сүрөтүн (C) көрсөтөт. Масштаб тилкеси 1μm (A жана B). Масштаб бирдиги 0,551μm (C). Gas1-GFP дискреттик ER аймактарында же кластерлеринде аныкталган, ал эми Mid2-iRFP ER мембранасы боюнча аныкталган жана бөлүштүрүлгөн (C). (D) График Gas1-GFP кластериндеги Gas1-GFP жана Mid2-iRFP салыштырмалуу флуоресценция интенсивдүүлүгүн ак жебе сызыгы боюнча (солдо) көрсөтөт. AU, каалаган бирдик. (E жана F) товарларды жана ERES белгисин айкалыштырган 3D сүрөттү билдирет. Gas1-GFP кластерлери белгилүү бир ERESтин жанында аныкталган. Масштаб бирдиги 0,551 мкм. (F) Ак түстөгү катуу жебе ERES менен байланышкан Gas1-GFP кластерин белгилейт. Ортоңку жана оң панелдер бириктирилген чоңойтулган 3D сүрөтүн жана тандалган Gas1-GFP кластеринин айландырылган көрүнүшүн көрсөтөт.
Gas1-GFP кластери менен белгилүү бир ERESтин ортосундагы тыгыз мейкиндик байланышы Gas1-GFP селективдүү ERESке кире аларын көрсөтүп турат, бул Mid2-iRFP тарабынан ERден чыгуу үчүн колдонулган селективдүүлүктөн айырмаланат. Бул мүмкүнчүлүктү чечүү үчүн биз ERES катышын бир же эки гана товар үчүн сандык түрдө аныктадык (2-сүрөт, А дан С га чейин). Көпчүлүк ERES (70%) бир гана жүк түрүн камтый турганын аныктадык. 2C сүрөтүнүн төмөнкү сүрөтүндө Gas1-GFP (1-сүрөт) же Mid2-iRFP (2-сүрөт) гана бар ERESтин эки типтүү мисалы көрсөтүлгөн. Ал эми ERESтин болжол менен 20% бир аймакта бири-бирине дал келген эки жүктү камтыйт. Айрым ERES (10%) эки түрдүү жүктү камтый турганы, бирок алар ар башка аймактарда изоляцияланганы аныкталган. Ошондуктан, бул статистикалык анализ ER экспорттолгондон кийин, GPI-AP Gas1-GFP жана трансмембраналык жүк Mid2-iRFP ар кандай ERESке бөлүнөрүн көрсөтүп турат (2D-сүрөт). Бул сорттоо эффективдүүлүгү мурунку биохимиялык анализге (6) жана морфологиялык аныктоого (7) абдан шайкеш келет. Ошондой эле, биз карантинге алынган жүктүн ERESке киргенин байкай алабыз (2E сүрөтү жана S2 тасмасы). 2E сүрөтүндө Gas1-GFP (3-панель) же Mid2-iRFP (4-панель) бир аз гана бөлүгү ERESке бир тараптан кирип, өзүнчө аймакта жайгашканы көрсөтүлгөн. 2E сүрөтүнүн 5-панелинде Gas1-GFP жана Mid2-iRFP кээде бир эле ERESте кездешери, бирок алар ар кайсы тараптан кирип, ар кандай COPII көбүкчөлөрүн билдириши мүмкүн болгон өзүнчө аймактарда топтолгону көрсөтүлгөн. Ошондой эле, биз C26 керамид негизиндеги GPI-AP Gas1ди селективдүү ERES катары бөлүү жана классификациялоо спецификалык экенин тастыктадык, анткени дагы бир трансмембраналык секреция жүкү, GFP менен белгиленген плазма мембранасынын белогу Axl2 (27), Mid2-iRFPге окшош жүрүм-турумду көрсөтөт. (S1 сүрөтү жана S3 тасмасы). Жаңы синтезделген Axl2-GFP ER мембранасы аркылуу Mid2-iRFP сыяктуу бөлүштүрүлөт (S1, A жана B сүрөттөрү) жана көпчүлүк ERESте Mid2-iRFP менен бирге жайгашкан (S1, B дан D га чейинки сүрөттөр). 1-сүрөттүн 1 жана 2-панельдери. S1C эки трансмембраналык жүктүн бири-бирине дал келген ERESтин эки типтүү мисалын көрсөтөт. Мындай учурларда эки товар тең ERESке чогуу кирет (S1E сүрөтү, 3-панель жана S3 тасмасы).
Галактозанын индукциялануучу секрецияларын экспрессиялаган sec31-1 клеткалары, Gas1-GFP (GPI-AP, жашыл) жана Mid2-iRFP (TMP, көк) жана Sec13-mCherry (ERES, кызгылтым) деп аталган курамдык ERES белгилөөчү клеткалар 37°C температурага жайгаштырылган. °C температурада 30 мүнөт инкубациялагандан кийин, секреция блогун бошотуу үчүн 24°C температурага жылдырыңыз жана 20 мүнөттөн кийин SCLIM менен сүрөткө тартыңыз. (Адан Сга чейин) Жүктүн жана ERES менен белгиленген 10 z-кесимдин репрезентативдик 2D проекциялык сүрөттөрү (А; масштаб тилкеси, 1μm) же 3D клетка жарым шарларынын сүрөттөрү (B жана C; масштаб бирдиги, 0,456μm). (B)деги төмөнкү панель жана (C)деги панель ERESте (кызгылтым) болгон товарларды гана көрсөтүү үчүн иштетилген сүрөттөрдү көрсөтөт [Gas1-GFP (боз) жана Mid2-iRFP (ачык көк)]. (C) Ачык жебе: ERES бир гана жүктү ташыйт (1ден 4кө чейин). Боз жебе: ERES өзүнчө жүктү камтыйт (5). Ак түстөгү бир бүтүн жебе: бирге жайгашкан жүктү камтыган ERES. Төмөндө: Тандалган бир ERES Gas1-GFP (1) же Mid2-iRFP (2) гана камтыйт. Масштаб тилкеси, 100 нм. (D) (C) сүрөттөлгөн фотомикрографтын сандык көрсөткүчү. Бир гана жүктү (Gas1-GFP же Mid2-iRFP), өзүнчө жүктү жана бири-бирине дал келген жүктү камтыган ERESтин орточо пайызы. Үч көз карандысыз экспериментте 54 уячада n=432. Ката тилкеси = SD. Эки куйруктуу жупташпаган t-тест. *** P = 0.0002. (E) (C) менен белгиленген карантинге алынган жүктүн тандалган ERESинин 3D сүрөтү. Gas1-GFP (жашыл) (3) же Mid2-iRFP (көк) (4) бир тараптан ERESке (кызгылтым) кирет жана ERESтин ичиндеги кичинекей аймак менен чектелген. Кээде эки түрдөгү жүк бир эле ЭРЕСке (5) бир тараптан кирип, ЭРЕСтин ичиндеги обочолонгон аймак менен чектелет. Масштаб тилкеси, 100 нм.
Андан кийин, биз ER мембранасында болгон узун ацил чынжырлуу керамид (C26) Gas1дин спецификалык кластерленишин жана селективдүү ERESке сорттолушун шарттайт деген гипотезаны текшердик. Бул үчүн биз модификацияланган ачыткы штаммын GhLag1 колдондук, анда эки эндогендик керамид синтазасы Lag1 жана Lac1 GhLag1 (пахтанын Lag1 гомологу) менен алмаштырылды, натыйжада клетка мембранасы жапайы типтен кыскараак Керамид штаммы бар ачыткы штаммы пайда болду (3A-сүрөт) (28). Массалык спектрометрия (MS) анализи жапайы типтеги штаммдарда жалпы керамиддин 95% өтө узун (C26) чынжырлуу керамид, ал эми GhLag1де керамиддин 85% өтө узун (C18 жана C16) экенин көрсөттү. ), керамиддин 2% гана өтө узун (C26) чынжырлуу керамид. C18 жана C16 керамиддери азырынча GhLag1 мембранасында аныкталган негизги керамиддер болгону менен, MS анализи ошондой эле GhLag1 штаммында экспрессияланган Gas1-GFPтин GPI анкеринде жапайы типтеги липиддерге салыштырмалуу C26 керамид бар экенин тастыктады. Сапаты бирдей (3A-сүрөт) (26). Демек, бул Cwh43 керамидди кайра түзүүчү ферменти C26 керамидине өтө селективдүү экенин билдирет, 26-сүрөттө көрсөтүлгөндөй, ал GhLag1 штаммындагы аз өлчөмдөгү C26 керамидинен GPI анкерин артыкчылыктуу түрдө камтыйт. S2 (29). Ошого карабастан, GhLag1 клетка мембранасында негизинен C18-C16 керамид гана бар, ал эми Gas1-GFPде дагы эле C26 керамид бар. Бул факт бул штаммды ERдеги мембраналык керамиддин ацил чынжырынын узундугу маселесин атайын чечүү үчүн идеалдуу куралга айлантат. Класстын жана сорттоонун гипотетикалык ролу. Андан кийин, биз алгач C26 Gas1-GFPнин GhLag1деги sec31-1 температурага сезгич мутант аллели менен кластерлерде топтолуу жөндөмүн кадимки флуоресценциялык микроскопия аркылуу изилдедик, мында ER мембранасындагы Ceramideде узун (C18-C16) чынжыр гана бар (3-сүрөт). Биз 31-1-секте Gas1-GFPнин көпчүлүк бөлүгү кластерлерде топтолгонун, ал эми узун (C18-C16) узун керамиддик ER мембранасы бар sec31-1 GhLag1деги Gas1-GFP негизинен кластерленген эмес жана бүтүндөй ER мембранасында бөлүштүрүлгөн эмес экенин байкадык. Тактап айтканда, C26 керамидине негизделген кластерлөө белгилүү бир ERES менен тыгыз байланышта болгондуктан (1-сүрөт), биз андан кийин бул процесс ER экспорттук белок механизминин функциясын да камтышы мүмкүнбү же жокпу, изилдедик. GPI-AP ER экспорту үчүн атайын COPII системасын колдонот, ал GPI анкеринин гликан бөлүгүн Ted1дин структуралык кайра түзүүсү менен активдүү түрдө жөнгө салынат (30, 31). Рекомбинанттык GPI-гликан андан кийин трансмембраналык жүк рецептору p24 комплекси тарабынан таанылат, ал өз кезегинде COPII жүк байланыштыруучу негизги Sec24 суббирдигинин спецификалык изоформасы болгон Lst1ди тандап алат, бул GPI-AP-га бай COPII везикулаларын түзөт (31-33). Ошондуктан, биз бул бир белоктордун (p24 комплексинин компоненти Emp24, GPI-гликанды кайра түзүүчү фермент Ted1 жана COPII спецификалык суббирдиги Lst1) делециясын sec31-1 мутант штаммы менен айкалыштырган кош мутант курдук жана аларды изилдедик. Gas1-кластердик GFP түзүү мүмкүнбү (3-сүрөт). Биз sec31-1emp24Δ жана sec31-1ted1Δ мезгилдеринде Gas1-GFP негизинен кластерленбеген жана ER мембранасы боюнча тараганын байкадык, мурда sec31-1 GhLag1де көрсөтүлгөндөй, ал эми sec31-1lst1Δ мезгилде Gas1-GFP sec31-1 сыяктуу. Бул жыйынтыктар ER мембранасында C26 керамидинин болушунан тышкары, Gas1-GFP кластерлениши дагы p24 комплексине байланышы керек экенин жана Lst1ди белгилүү бир түрдө тартууну талап кылбай турганын көрсөтүп турат. Андан кийин, биз ER мембранасындагы керамид чынжырынын узундугу Gas1-GFPнин p24 менен байланышын жөнгө сала ала тургандыгын изилдедик. Бирок, биз мембранада C18-C16 керамидинин болушу p24 комплекси тарабынан калыбына келтирилген GPI-гликандарга (S3 жана S4, A жана B сүрөттөрү) же GPI-AP менен байланышып, GPI-AP экспорттоо жөндөмүнө таасир этпей турганын аныктадык. COPII Lst1 субтибин тартуу (S4C сүрөт). Ошондуктан, C26 керамидге көз каранды кластерлөө ар кандай ER экспорттук белок механизмдери менен белоктун өз ара аракеттенүүсүн талап кылбайт, бирок липиддердин узундугу менен башкарылуучу альтернативдүү сорттоо механизмин колдойт. Андан кийин, биз ER мембранасындагы керамид ацил чынжырынын узундугу Gas1-GFPди селективдүү ERES катары натыйжалуу классификациялоо үчүн маанилүүбү же жокпу, талдап чыктык. Кыска чынжырлуу керамид менен GhLag1 штаммындагы Gas1 ERден чыгып, плазма мембранасына киргендиктен (S5 сүрөт), эгерде сорттоо керамид ацил чынжырынын узундугу менен башкарылса, GhLag1 штаммындагы Gas1 кайра багытталып, кесилиши мүмкүн деп эсептейбиз. Ошол эле мембрана менен ERES товарлары.
(A) GhLag1 клетка мембранасы негизинен кыскараак C18-C16 керамиддерин камтыйт, ал эми Gas1-GFP GPI анкери жапайы типтеги клеткалардай эле C26 IPCге ээ. Жогоруда: жапайы типтеги (Wt) жана GhLag1p штаммдарынын клетка мембранасындагы керамиддин ацил чынжырынын узундугун массалык спектрометрия (MS) аркылуу талдоо. Маалыматтар жалпы керамиддин пайызын билдирет. Үч көз карандысыз эксперименттин орточо мааниси. Ката тилкеси = SD. Эки куйруктуу жупташпаган t-тест. **** P <0.0001. Төмөнкү панель: жапайы типтеги жана GhLag1p штаммдарында көрсөтүлгөн Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI анкеринде бар болгон IPCнин ацил чынжырынын узундугун MS талдоо. Маалыматтар жалпы IPC сигналынын пайызын билдирет. Беш көз карандысыз эксперименттин орточо мааниси. Ката тилкеси = SD. Эки куйруктуу жупташпаган t-тест. ns, маанилүү эмес. P = 0.9134. (B) Галактоза менен индукцияланган Gas1-GFP экспрессиялаган sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ жана sec31-1lst1Δ клеткаларынын флуоресценциялык микрографиялары 37°C температурада 30 мүнөт инкубацияланып, 24°C температурадан кийин кадимки флуоресценциялык микроскопияны жүргүзүү үчүн өткөрүлүп берилген. Ак жебе: ER Gas1-GFP кластери. Ачык жебе: Кластерленбеген Gas1-GFP бүтүндөй ER мембранасына бөлүштүрүлүп, ER мүнөздүү ядролук шакекче боёгун көрсөтөт. Масштаб тилкеси, 5μm. (C) (B) сүрөттөлгөн фотомикрографиянын сандык көрсөткүчү. Нуктай Gas1-GFP түзүлүшү бар клеткалардын орточо пайызы. Үч көз карандысыз экспериментте n≥300 клетка. Ката тилкеси = SD. Эки куйруктуу жупташпаган t-тест. **** P <0.0001.
Бул көйгөйдү түздөн-түз чечүү үчүн, биз sec31-1 температурага сезгич мутант аллели менен GhLag1деги Gas1-GFP жана Mid2-iRFPти SCLIM визуализациясын жүргүздүк (4-сүрөт жана S4 тасмасы). ER 37°C температурада кармалып, андан кийин 24°C температурада бөлүнүп чыккандан кийин, жаңы синтезделген Gas1-GFP көпчүлүк бөлүгү кластерленген эмес жана ER мембранасы боюнча тараган эмес, бул кадимки микроскоптор менен байкалган (4-сүрөт, A жана B). Мындан тышкары, ERESтин чоң пайызы (67%) анда бирге жайгашкан эки түрдөгү жүктү камтыйт (4D-сүрөт). 4C сүрөтүнүн 1 жана 2-панелдеринде Gas1-GFP жана Mid2-GFP бири-бирине дал келген ERESтин эки типтүү мисалы көрсөтүлгөн. Мындан тышкары, эки товар тең бир эле ERESке кошулган (4E-сүрөт, 3-панел жана S4 тасмасы). Ошондуктан, биздин жыйынтыктар ER мембранасындагы керамид ацил чынжырынын узундугу ER белокторунун агрегациясынын жана классификациясынын маанилүү детерминанты экенин көрсөтүп турат.
Sec31-1 Галактоза менен индукцияланган секрецияларды экспрессиялаган GhLag1 клеткалары, Gas1-GFP (GPI-AP, жашыл) жана Mid2-iRFP (TMP, көк) жана ERES менен белгиленген Sec13-mCherry (ERES, кызгылтым) 37°C температурада инкубациялаңыз. 30 мүнөт улантыңыз, секрецияларды чыгаруу үчүн 24°C чейин түшүрүңүз жана 20 мүнөттөн кийин SCLIM менен сүрөткө тартыңыз. (Адан Сга чейин) Жүк жана ERES менен белгиленген 10 z-кесимдин репрезентативдик 2D проекциялык сүрөттөрү (А; масштаб тилкеси, 1μm) же 3D клетка жарым шарларынын сүрөттөрү (B жана C; масштаб бирдиги, 0,45μm). (B)деги төмөнкү панель жана (C)деги панель ERESте бар болгон товарларды гана көрсөтүү үчүн иштетилген сүрөттөрдү көрсөтөт (кызгылтым) [Gas1-GFP (боз) жана Mid2-iRFP (ачык көк)]. (C) Ак түстөгү жебе: ERES, товарлар бири-бирине дал келет. Ачык жебе: ERES бир гана нерсени камтыйт. Төмөнкү панель: Тандалган ERESте (C) белгиленген бирине дал келген товарлар (1 жана 2) бар. Масштаб тилкеси, 100 нм. (D) (C) белгиленген фотомикрографтын сандык көрсөткүчү. 31-1 жана 31-1 GhLag1 бирдиктеринде бир гана жүк (Gas1-GFP же Mid2-iRFP) камтылган жана обочолонгон жүк жана бирине дал келген жүк үчүн ERESтин орточо пайызы көрсөтүлгөн. Үч көз карандысыз экспериментте 54 уячада n = 432 (31-1-1-1) жана 47 уячада n = 430 (31-1-1 GhLag1). Ката тилкеси = SD. Эки куйруктуу жупташпаган t-тест. *** P = 0.0002 (31-1-1-1) жана ** P = 0.0031 (31-1-1 GhLag1). (E) (C) белгиленген бирине дал келген жүк (3) менен тандалган ERESтин 3D сүрөтү. Gas1-GFP (жашыл) жана Mid2-iRFP (көк) ERESке (кызгылт көк) бир тараптан жакындап, ошол эле ERES чектелген аймагында турушат. Масштаб тилкеси, 100 нм.
Бул изилдөө липиддик негиздеги белок жүктөрү секретордук жолдо тандалма экспорттук жерлерге бөлүнөрүн in vivo далилдейт жана классификациянын тандалмалуулугу үчүн ацил чынжырынын узундугунун маанисин ачып берет. SCLIM деп аталган күчтүү жана заманбап микроскопия ыкмасын колдонуп, биз ачыткыда жаңы синтезделген Gas1-GFP (абдан узун ацил чынжыры (C26) керамид липиддик бөлүгү бар негизги плазмалык мембрана GPI-AP) көрсөттүк. Дискреттик ERлерде топтолгон аймактар ​​белгилүү бир ERES менен байланышкан, ал эми трансмембраналык бөлүнүп чыккан белоктор ER мембранасы боюнча бөлүштүрүлөт (1-сүрөт). Мындан тышкары, бул эки типтеги товарлар ар кандай ERESке тандалма түрдө кирет (2-сүрөт). Мембранадагы клеткалык керамиддин ацил чынжырынын узундугу C26дан C18-C16га чейин кыскарат, Gas1-GFP кластери дискреттик ER аймагына бузулат жана Gas1-GFP ошол эле ERES аркылуу трансмембраналык белок менен ERден кетүү үчүн кайра багытталат (3-сүрөт жана 3-сүрөт). 4).
GPI-AP ERден чыгуу үчүн адистештирилген белок механизмин колдонсо да, биз C26 керамидге көз каранды бөлүнүү ERES адистешүүсүнө алып келиши мүмкүн болгон дифференциалдык белок өз ара аракеттенүүлөрүнө таянбай турганын аныктадык (S4 жана S5 сүрөттөр). Анын ордуна, биздин жыйынтыктар липидге негизделген белок кластерлөө жана андан кийин башка жүктөрдү алып салуу менен шартталган альтернативдүү классификация механизмин колдойт. Биздин байкоолорубуз белгилүү бир ERES менен байланышкан Gas1-GFP аймагында же кластеринде трансмембраналык бөлүнүп чыккан Mid2-iRFP белогу жок экенин көрсөтүп турат, бул C26 керамидге көз каранды GPI-AP кластери алардын тиешелүү ERESке киришин жеңилдетет жана ошол эле учурда трансмембраналык бөлүнүп чыгууларды алып салат (1 жана 2-сүрөттөр). Ал эми, ER мембранасында C18-C16 керамиддеринин болушу GPI-AP аймактарды же кластерлерди пайда кылышына алып келбейт, ошондуктан алар трансмембраналык бөлүнүп чыккан белокторду ошол эле ERESке алып салбайт же алмаштырбайт (3 жана 4-сүрөттөр). Ошондуктан, биз C26 керамиди белгилүү бир ERES менен байланышкан белоктордун кластерленишин жеңилдетүү менен бөлүнүүнү жана классификациялоону шарттайт деп сунуштайбыз.
Бул C26 керамидге көз каранды кластерди белгилүү бир ER аймагына кантип жетүүгө болот? Мембраналык керамиддин капталдан бөлүнүү тенденциясы GPI-AP жана C26 керамидинин кыска жана каныкпаган глицеролипиддерди камтыган ER мембранасынын бир калыптагы эмес липиддик чөйрөсүндө кичинекей жана заматта тартиптелген липиддерди пайда кылышына алып келиши мүмкүн. Сапаттуу кластерлер (17, 18). Бул кичинекей убактылуу кластерлер p24 комплексине байланышкандан кийин чоңураак, туруктуураак кластерлерге андан ары биригиши мүмкүн (34). Буга ылайык, биз C26 Gas1-GFP чоңураак көрүнгөн кластерлерди түзүү үчүн p24 комплекси менен өз ара аракеттениши керек экенин көрсөттүк (3-сүрөт). p24 комплекси - ачыткыдагы төрт башка p24 трансмембраналык белокторунан турган гетерозиготалуу олигомер (35), ал көп валенттүү байланышты камсыз кылат, бул кичинекей GPI-AP кластерлеринин кайчылаш байланышына алып келиши мүмкүн, ошону менен чоңураак Туруктуу кластерди пайда кылат (34). GPI-AP белок эктодомендеринин өз ара аракеттенүүсү алардын агрегациясына да салым кошушу мүмкүн, бул сүт эмүүчүлөрдүн поляризацияланган эпителий клеткаларындагы Гольджи ташуу учурунда көрүнүп турат (36). Бирок, ER мембранасында C18-C16 керамиди болгондо, p24 комплекси Gas1-GFP менен байланышканда, чоң өзүнчө кластерлер пайда болбойт. Негизги механизм узун ацил чынжырлуу керамиддин өзгөчө физикалык жана химиялык касиеттерине көз каранды болушу мүмкүн. Жасалма мембраналардын биофизикалык изилдөөлөрү көрсөткөндөй, узун (C24) жана кыска (C18-C16) ацил чынжырлуу керамиддер фазанын бөлүнүшүн пайда кылышы мүмкүн, бирок узун ацил чынжырлуу керамиддер (C24) гана пленканын формасын өзгөртүү үчүн жогорку ийриликти жана пленканын ийилишин күчөтө алат. Өз ара шилтеме аркылуу (17, 37, 38). Emp24түн адам гомологу болгон TMED2нин трансмембраналык спиралы цитоплазмалык бөлүкчөлөрдө C18 керамид негизиндеги сфингомиелин менен тандалма түрдө өз ара аракеттенери көрсөтүлдү (39). Молекулярдык динамика (MD) симуляцияларын колдонуп, биз C18 жана C26 керамиддеринин экөө тең Emp24 трансмембраналык спиралынын цитоплазмалык бөлүкчөлөрүнүн айланасында топтолорун жана алардын артыкчылыктары окшош экенин аныктадык (S6-сүрөт). Белгилей кетүүчү нерсе, бул Emp24түн трансмембраналык спиралы мембранада липиддердин асимметриялык таралышына алып келиши мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Бул сүт эмүүчүлөрдүн клеткаларына негизделген акыркы жыйынтык. Окшош MD симуляциялары эфир липиддеринин бар экендигин да көрсөтөт (40). Ошондуктан, биз ER26нын эки бөлүкчөсүндөгү C26 керамидинин жергиликтүү түрдө байытылганын божомолдойбуз. Люминалдык лобулалардагы GPI-AP көп валенттүү p24 менен түздөн-түз байланышып, цитоплазмалык лобулалардагы p24 айланасында C26 керамидинин топтолушун шарттаганда, ал протеиндердин агрегациясын жана мембрананын ийрилигин манжалар аркылуу пайда кылат (41), бул GPI-APтын ERESке жакын жайгашкан дискреттик аймактарга бөлүнүшүнө алып келет, бул да ER мембранасынын өтө ийри аймактарына өбөлгө түзөт (42). Мурунку отчеттор сунушталган механизмди колдогон (43, 44). Олиголектиндердин, патогендердин же антителолордун плазма мембранасында керамидге негизделген гликосфинголипиддерге (GSL) көп валенттүү байланышы чоң GSL агрегациясын пайда кылат, фазанын бөлүнүшүн күчөтөт жана мембрананын деформациясын жана интернализациясын пайда кылат (44). Ивабучи ж.б. (43) Узун (C24), бирок кыска эмес (C16) ацил чынжырларынын катышуусунда, GSL лактозилцерамидине байланышкан көп валенттүү лиганд чоң кластерлердин пайда болушун жана мембрана инвагинациясын пайда кылганы жана цитоплазмада Lyn аркылуу сигналдын трансдукциясы баракчалардагы байланышкан нейтрофилдердеги ацил чынжырлары менен өз ара байланышта экени аныкталган.
Сүт эмүүчүлөрдүн поляризацияланган эпителий клеткаларында анти-Гольджи тармагынын (TGN) апикалдык плазма мембранасынын деңгээлине концентрациясы GPI-AP бөлүнүшүн жана сорттолушун көзөмөлдөйт (10, 45). Бул агрегация GPI-AP олигомеризациясы менен шартталат (36), бирок ал ачыткыда кездешкен керамид чынжырынын узундугунан да көз каранды болушу мүмкүн. Сүт эмүүчүлөрдүн GPI-AP эфир липидине негизделген якорьго ээ болгону жана анын химиялык түзүлүшү өтө узун ацил чынжырлуу керамидден абдан айырмаланганы менен, жакында жүргүзүлгөн бир изилдөө эки липид тең эволюциялык жактан окшош физикалык жана химиялык касиеттерге жана функцияга ээ экенин көрсөттү (40). Ошондуктан, сүт эмүүчүлөрдүн клеткаларындагы эфир липиддик бөлүгү ачыткыдагы C26 керамидине окшош болушу мүмкүн жана анын ролу мембранадагы узун чынжырлуу керамид менен байланышып, GPI-AP агрегациясын жана сорттолушун күчөтүү болуп саналат. Бул мүмкүнчүлүктү дагы эле түздөн-түз текшерүү керек болсо да, мурунку ачылыштар узун ацил чынжырлуу керамидди Гольджи денесине ташуу цитоплазмалык ташуучу белоктор тарабынан эмес, ачыткы сыяктуу GPI анкерлеринин синтезинен көз каранды экенин тастыктайт. Ошондуктан, эволюциялык консервативдик механизм бир эле ташуучу везикулада өтө узун ацил чынжырлуу керамидди жана GPI-APди (13, 16, 20, 46, 47) тандап бирге ташый алат окшойт.
Ачыткы жана сүт эмүүчүлөрдүн поляризацияланган эпителий клетка системаларында GPI-AP агрегациясы жана башка плазмалык мембрана белокторунан бөлүнүшү клетканын бетине жеткенге чейин жүрөт. Паладино жана башкалар (48) сүт эмүүчүлөрдүн поляризацияланган эпителий клеткаларынын TGNинде GPI-AP кластерлешүүсү GPI-APтерди апикалдык плазмалык мембранага тандап классификациялоо үчүн гана эмес, ошондой эле GPI-APтердин кластерлешүү уюмун жана анын биологиялык активдүүлүгүн жөнгө салат деп аныкташкан. Клетка бети. Ачыткыда бул изилдөө ERдеги C26 керамидге көз каранды GPI-AP кластери плазмалык мембранадагы GPI-APтин кластердик уюмун жана функционалдык активдүүлүгүн жөнгө сала аларын көрсөттү (24, 49). Бул моделге ылайык, GhLag1 клеткалары GPI ингибиторлоруна же клетка дубалынын бүтүндүгүнө таасир этүүчү дары-дармектерге аллергиясы бар (28) жана ачыткы клеткаларынын жупташуусунда проекцияланган учтук керамиддин функционалдык Gas1-GFP кластерлерине болгон муктаждык (49) G көрсөтүп турат​​ hLag1 клеткаларынын мүмкүн болгон физиологиялык кесепеттери. GPI-AP катасы. Бирок, клетка бетинин функционалдык уюму липиддердин узундугуна негизделген сорттоо ыкмасы менен ERден программаланганбы же жокпу, андан ары текшерүү биздин келечектеги изилдөөбүздүн темасы болот.
Бул иште колдонулган Saccharomyces cerevisiae штаммдары S1 таблицасында келтирилген. Тирүү клеткаларды сүрөткө тартуу үчүн SCLIMдин MMY1583 жана MMY1635 штаммдары W303 фонунда курулган. Sec13-mCherryди флуоресценттик белок теги менен экспрессиялаган бул штаммдар полимераз чынжыр реакциясына (ПЧР) негизделген ыкманы колдонуу менен pFA6a плазмидасын шаблон катары колдонуу менен курулган (23). GAL1 промоторунун көзөмөлүндө флуоресценттик белок менен белгиленген Mid2-iRFP экспрессиялаган штамм төмөнкүдөй курулган. pKTiRFP-KAN векторунан iRFP-KanMx ырааттуулугун ПЧР менен күчөтүү (Э. О'Ши белеги, Addgene плазмид номери 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; изилдөө ресурсунун идентификатору (RRID): Addgene_64687) Жана эндогендик Mid2нин С-терминалына киргизилген. Mid2-iRFP геномунун ырааттуулугу күчөтүлүп, GAL1 промоторуна клондолгондон кийин, ал pRS306 интеграциялык плазмиданын Not I-Sac I сайтына интеграцияланган. Алынган pRGS7 плазмиди URA3 локусуна интеграциялануу үчүн Pst I менен сызыктуу болгон.
Gas1-GFP биригүү гени центромера (CEN) плазмидасында GAL1 промоторунун көзөмөлүндө экспрессияланат, ал төмөнкүдөй курулган. Gas1-GFP ырааттуулугу pRS416-GAS1-GFP плазмидинен (24) (Л. Пополонун белеги) ПЦР аркылуу күчөтүлүп, CEN плазмидасы pBEVY-GL LEU2 (C белеги) Xma I–Xho I сайтына клондолгон. Миллер; Адджен плазмидасы № 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Алынган плазмидага pRGS6 деген ат берилген. Axl2-GFP биригүү гени да pBEVY-GL LEU2 векторунун GAL1 промоторунун көзөмөлүндө экспрессияланат жана анын түзүлүшү төмөнкүдөй. Axl2-GFP ырааттуулугу pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмидинен (23) ПЦР аркылуу күчөтүлүп, pBEVY-GL LEU2 векторунун Bam HI-Pst I сайтына клондолгон. Алынган плазмид pRGS12 деп аталган. Бул изилдөөдө колдонулган олигонуклеотиддердин ырааттуулугу S2 таблицасында келтирилген.
Штамм көмүртек булагы катары 0,2% аденин жана 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноза [YP-рафиноза] бай ачыткы экстракты протеини p (YP) чөйрөсү (1% ачыткы экстракты жана 2% протеин ept). (YPR)] же 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] менен, же азыктануу үчүн зарыл болгон тиешелүү аминокислоталарды жана негиздерди толуктоо үчүн синтетикалык минималдуу чөйрөдө (0,15% ачыткы азот негизи жана 0,5% аммоний сульфаты) кошулган, ал эми көмүртек булагы катары 2% глюкоза (синтетикалык глюкоза минималдуу чөйрөсү) же 2% галактоза (синтетикалык галактоза минималдуу чөйрөсү) камтылган.
Реалдуу убакыттагы сүрөткө тартуу үчүн, GAL1 промоторунун астындагы конструкцияны экспрессиялаган температурага сезгич sec31-1 мутант клеткалары YPR чөйрөсүндө 24°C температурада түнү бою өстүрүлүп, ортоңку логарифмдик фазага чейин жеткен. YPGде 24°C температурада 1 саат индукциялангандан кийин, клеткалар SGде 37°C температурада 30 мүнөт инкубацияланып, андан кийин секреция блогунан чыгуу үчүн 24°C температурага которулган. Клеткаларды айнек слайдга бекитүү үчүн Конканавалин А колдонулган жана SCLIM аркылуу сүрөткө тартылган. SCLIM - бул Olympus IX-71 инверттелген флуоресценциялык микроскопунун жана UPlanSApo 100×1.4 сандык апертуралык май линзасынын (Olympus), жогорку ылдамдыктагы жана жогорку сигнал-ызы-чуу катышындагы айлануучу диск конфокалдык сканеринин (Yokogawa Electric), ылайыкташтырылган спектрометрдин жана ылайыкташтырылган муздатуунун айкалышы. Системанын сүрөт күчөткүчү (Hamamatsu Photonics) акыркы чоңойтуу ×266.7 чоңойтуучу линза системасын жана электрондорду көбөйтүүчү заряд менен байланышкан түзмөк камерасын (Hamamatsu Photonics) камсыздай алат (21). Сүрөттү алуу ылайыкташтырылган программалык камсыздоо (Yokogawa Electric) тарабынан аткарылат. 3D сүрөттөр үчүн биз объектив линзасын вертикалдуу терметүү үчүн ылайыкташтырылган пьезоэлектрдик кыймылдаткычты колдондук жана оптикалык бөлүктөрүн 100 нм аралыкта стек катары чогулттук. Z-стек сүрөтү 3D вокселдик маалыматтарга айландырылат, ал эми айлануучу диск конфокалдык микроскобу үчүн колдонулган теориялык чекиттин жайылышы функциясы Volocity программалык камсыздоосу (PerkinElmer) тарабынан деконволюциялык иштетүү үчүн колдонулат. Жүктөрдү кошо алганда, ERESтин колокациялык анализинин босогосун автоматтык түрдө аныктоо үчүн Volocity программасын колдонуу менен өлчөнгөн. Сызыктарды сканерлөө анализи MetaMorph программасын (Molecular Devices) колдонуу менен жүргүзүлгөн.
Статистикалык маанилүүлүктү аныктоо үчүн GraphPad Prism программасын колдонуңуз. Эки тараптуу Студенттин t-тестинде жана кадимки бир тараптуу дисперсиялык анализ (ANOVA) тестинде топтордун ортосундагы айырмачылыктар P <0.05 (*) көрсөткүчүнө олуттуу таасир этет деп эсептелет.
Gas1-GFP флуоресценциялык микроскопиясы үчүн логарифмдик фаза клеткалары YPDде түнү бою өстүрүлүп, центрифугалоо жолу менен чогултулуп, фосфат буферленген туздуу эритме менен эки жолу жуулуп, музда кеминде 15 мүнөт инкубацияланып, андан кийин мурда сүрөттөлгөндөй микроскоп астында жүргүзүлдү (24-текшерүү). Алуу үчүн объективдүү линза, L5 (GFP) чыпкасы, Hamamatsu камерасы жана Application Suite X (LAS X) программасы менен жабдылган Leica DMi8 микроскобу (HCX PL APO 1003/1.40 май PH3 CS) колдонулган.
Үлгүлөр SDS үлгү буфери менен 65°C температурада 10 мүнөт денатурацияланып, андан кийин SDS-полиакриламид гелинин электрофорези (PAGE) менен бөлүнгөн. Иммуноблоттинг анализи үчүн ар бир тилкеге ​​10 мкл үлгү жүктөлгөн. Негизги антитело: 1:3000 суюлтууда коёндун поликлоналдык анти-Gas1, 1:500 суюлтууда коёндун поликлоналдык анти-Emp24 жана 1:3000 суюлтууда коёндун поликлоналдык анти-GFP (Х. Ризмандын белеги) колдонуңуз. Чычкандын моноклоналдык анти-Pgk1 антителосу 1:5000 суюлтууда колдонулган (Ж. де ла Круздун белеги). Экинчилик антитело: Хрен пероксидазасы (HRP) конъюгацияланган эчкинин коёнго каршы иммуноглобулини G (IgG) 1:3000 суюлтууда колдонулган (Пирс). HRP менен конъюгацияланган эчкинин чычканга каршы IgG антителосу 1:3000 (Пирс) суюлтуу менен колдонулган. Иммундук жооп зонасы SuperSignal West Pico реактивинин (Thermo Fisher Scientific) хемилюминесценция ыкмасы менен байкалган.
(31)де сүрөттөлгөндөй, байытылган ER фракциясында табигый иммунопреципитация эксперименти жүргүзүлдү. Кыскасы, ачыткы клеткаларын TNE буфери [50 мМ трис-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид жана протеаза ингибиторунун аралашмасы) менен 600 нмде (OD600) 100 оптикалык тыгыздыкта эки жолу жууңуз. Ал айнек мончоктор менен талкаланып, андан кийин клетка калдыктары жана айнек мончоктор центрифугалоо жолу менен алынып салынган. Андан кийин супернатант 17 000 г ылдамдыкта 4°C температурада 15 мүнөт центрифугаланган. Гранул TNEде кайра эритилип, дигиталис сапонини 1% акыркы концентрацияга чейин кошулган. Суспензия 4°C температурада айландыруу менен 1 саат инкубацияланган, андан кийин эрибеген компоненттер 13 000 г ылдамдыкта 4°C температурада 60 мүнөт центрифугалоо жолу менен алынып салынган. Gas1-GFP иммунопреципитациясы үчүн алгач үлгүнү бош агароза бүртүкчөлөрү (ChromoTek) менен 4°C температурада 1 саат алдын ала инкубациялап, андан кийин GFP-Trap_A (ChromoTek) менен 4°C температурада 3 саат инкубациялаган. Иммунопреципитацияланган бүртүкчөлөр 0,2% дигоксигенин камтыган TNE менен беш жолу жуулуп, SDS үлгү буфери менен элюцияланып, SDS-PAGEде бөлүнүп, иммуноблоттоо жолу менен талданган.
(31) сүрөттөлгөндөй, байытылган ЭР фракциясында кайчылаш байланышты аныктоо жүргүзүлдү. Кыскача айтканда, байытылган ЭР фракциясы 0,5 мМ дитиобис (сукцинимидил пропионаты) менен инкубацияланган (Пирс, Термо Фишер Сайенфи, Рокфорд, Иллинойс, АКШ; 20°C, 20 мүнөт). Кайчылаш байланыш реакциясы глицин кошуу менен басылган (50 мМ акыркы концентрация, 5 мүнөт, 20°C).
Мурда сүрөттөлгөндөй (50), жапайы типтеги жана GhLag1 штаммдарындагы керамиддин MS анализи жүргүзүлдү. Кыскасы, клеткалар YPDде 30°C температурада экспоненциалдык фазага (3төн 4кө чейин OD600 бирдик/мл) чейин өстүрүлүп, 25×107 клетка жыйналды. Алардын метаболизми трихлоруксус кислотасы менен басылды. Экстракциялык эриткичти [этанол, суу, эфир, пиридин жана 4,2 Н аммоний гидроксиди (15:15:5:1:0,018 v/v)] жана ички стандарттуу C17 керамидинин 1,2 нмоль (860517, Avanti полярдык липид) сапатын колдонуңуз. Экстракттын жеңил щелочтуу гидролизин жүргүзүү үчүн монометиламин реагентин [метанол, суу, n-бутанол жана метиламин эритмесин (4:3:1:5 v/v)] колдонуңуз, андан кийин тузсуздандыруу үчүн сууга каныккан n-бутанолду колдонуңуз. Акырында, экстракт оң режимдеги эриткичте [хлороформ/метанол/суу (2:7:1) + 5 мМ аммоний ацетаты] кайра эритилип, масса-спектрометрге сайылды. Сфинголипид молекулаларын аныктоо жана сандык жактан аныктоо үчүн көп реакциялуу мониторинг (MRM) жүргүзүлдү. TSQ Vantage үчүнчү даражадагы квадруполдук масса-спектрометри (Thermo Fisher Scientific) липиддерди анализдөө үчүн роботтук нанофлоймдук ион булагы Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Нью-Йорк) менен жабдылган. Кагылышуу энергиясы ар бир керамид категориясы үчүн оптималдаштырылган. MS маалыматтары оң режимде алынган. Ар бир биологиялык кайталоо үчүн липиддик сигнал үч көз карандысыз өлчөөнүн медианасы болуп саналат.
(31) сүрөттөлгөндөй, Gas1-GFP экспрессиялаган клеткалар (800 × 107) табигый иммунопреципитацияга дуушар болушкан. Тазаланган Gas1-GFP SDS-PAGE менен бөлүнүп, поливинилиден фторид (PVDF) мембранасына өткөрүлгөн. Белок PVDFти амид кара түскө боёо менен визуализацияланган. Gas1-GFP тилкеси PVDFтен кесилип, 5 жолу метанол менен жана бир жолу суюк хроматография-MS (LC-MS) класстагы суу менен жуулган. Мембрана тилкесин 500 мкл 0,3 М NaOAc (рН 4,0), буфер жана 500 мкл жаңы эритилген 1 М натрий нитрит аралашмасы менен 37°C температурада 3 саат инкубациялоо менен липиддик фракция Gas1-GFPден бөлүнүп чыгып, лизиске учурайт. Глюкозамин менен инозитолдун ортосундагы инозин фосфат керамидинин бөлүнүп чыгышы (51). Андан кийин, мембраналык тилке LC-MS классындагы суу менен төрт жолу жуулуп, бөлмө температурасында кургатылган жана анализге чейин -80°C температурада азот атмосферасында сакталган. Контролдук катары ар бир эксперимент үчүн PVDF мембранасынын бош үлгүсү колдонулган. Андан кийин Gas1-GFPден алынган липид (50) сүрөттөлгөндөй MS менен талданган. Кыскасы, GPI-липидин камтыган PVDF тилкелери 75 мкл терс көк эриткичинде [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммоний ацетаты] кайра эритилип, сфинголипид түрлөрүнүн электроспрей иондоштуруусунан (ESI)-MRM/MS анализинен (TSQ Vantage) өткөн. Бул учурда, MS маалыматтары терс ион режиминде алынган.
Жогоруда айтылгандай, GPI анкеринин липиддик бөлүгү [3H]-инозитол менен белгиленген GPI-AP (16) дан бөлүнгөн. Липиддер эриткич системасын (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) колдонуу менен жука катмарлуу хроматография аркылуу бөлүнүп, FLA-7000 (Fujifilm) аркылуу визуалдаштырылган.
Gas1-GFP (600 × 107) экспрессиялаган клеткалар TNE буфери бар TNE буфери менен эки жолу жуулуп, айнек шурулары менен талкаланып, андан кийин клетка калдыктарын жана айнек шуруларын алып салуу үчүн центрифугаланган. Андан кийин супернатант 17 000 g температурада 4°C температурада 1 саат бою центрифугаланган. Пеллет TNEде жуулуп, 0,2% дигиталис сапонинин камтыган TNEде 1 U PI-PLC (Invitrogen) менен 37°C температурада 1 саат бою инкубацияланган. Фермент менен иштетилгенден кийин, мембрана 17 000 g температурада 4°C температурада 1 саат бою центрифугалоо жолу менен алынып салынган. Gas1-GFP иммунопреципитациялоо үчүн супернатант GFP-Trap_A (ChromoTek) менен 4°C температурада түнү бою инкубацияланган. SDS-PAGE менен бөлүнгөн тазаланган Gas1-GFP Кумассинин бриллиант көк түсү менен боёлгон. Gas1-GFP боёочу тилкеси акведуктун айланасындагы боз түстөн кесилген, андан кийин йодоацетамид менен алкилдөөдөн жана дитиотреитол менен калыбына келтирүүдөн кийин трипсин менен гель ичиндеги сиңирүү жүргүзүлгөн. Экстракт жана GPI-гликандар менен триптикалык пептиддер жана пептиддер кургатылган. Кургатылган пептид 20 мкл сууда эриген. Бир бөлүгүн (8 мкл) LCге куюңуз. Белгилүү бир градиент шарттарында пептиддерди бөлүү үчүн октадецилсилан (ODS) колонкасы (Develosil 300ODS-HG-5; ички диаметри 150 мм×1,0 мм; Nomura Chemical, Айчи префектурасы, Япония) колдонулган. Кыймылдуу фаза - эриткич А (0,08% кумурска кислотасы) жана эриткич В (0,15% кумурска кислотасы 80% ацетонитрилде). Accela HPLC системасы (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс) колонканы А эриткичи менен 55 мүнөттүн ичинде 50 мкл мин-1 агым ылдамдыгында элюциялоо үчүн колдонулган, андан кийин В эриткичинин концентрациясы 40% га чейин жогорулатылган. , АКШ). Элюат ESI ион булагына үзгүлтүксүз киргизилип, триптикалык пептиддер жана GPI-гликандары бар пептиддер LTQ Orbitrap XL (гибриддик сызыктуу ион тузагы-орбитрап массалык спектрометри; Thermo Fisher Scientific) менен талданган. MS орнотуусунда капиллярдык булагынын чыңалуусу 4,5 кВга коюлган, ал эми өткөрүүчү капиллярдын температурасы 300°Cде кармалган. Капиллярдык чыңалуу жана түтүк линзасынын чыңалуусу тиешелүүлүгүнө жараша 15 В жана 50 Вга коюлган. MS маалыматтары оң иондук режимде (чечилиши 60 000; массанын тактыгы миллионго 10 бөлүк) 300/м/з масса/заряд катышы (м/з) 3000 массалык диапазонунда алынган. MS/MS маалыматтары LTQ Orbitrap XLдеги иондук тузак аркылуу алынган [маалыматтар көз каранды болгон алгачкы 3 сан, кагылышуудан келип чыккан диссоциация (CID)].
MD симуляциялары GROMACS (52) программасын жана MARTINI 2 күч талаасын (53-55) колдонуу менен жүргүзүлдү. Андан кийин CHARMM GUI мембрана куруучу (56, 57) диолеойлфосфатидилхолинди (DOPC) жана Cer C18 же DOPC жана Cer C26 камтыган эки катмарлуу катмарды куруу үчүн колдонулган. Cer C26 топологиясы жана координаттары сфингозин куйругунан ашыкча мончокторду алып салуу менен DXCEден алынат. Кош катмарды тең салмактап, аны иштетүү үчүн төмөндө сүрөттөлгөн процессти колдонуңуз, андан кийин Emp24 камтыган системаны куруу үчүн системанын акыркы координаттарын колдонуңуз. Ачыткы Emp24түн трансмембраналык домени (173төн 193кө чейинки калдыктар) визуалдык MD (VMD) куралынын молекулярдык түзүлүшүн (58) колдонуу менен α-спираль катары курулган. Андан кийин, бири-бирине жабышкан липиддерди алып салгандан кийин, белок одоно гранулданып, CHARMM GUI колдонуп эки катмарлуу катмарга киргизилген. Акыркы система 1202 DOPC жана 302 Cer C26 же 1197 DOPC жана 295 Cer C18 жана Emp24 камтыйт. Системаны 0,150 М концентрациясына чейин иондоштуруңуз. Эки катмарлуу композиция үчүн төрт көз карандысыз кайталоо жасалган.
Липиддик эки катмар CHARMM GUI процессин колдонуу менен тең салмакталат, ал 405 000 кадамды минималдаштырууну жана андан кийин тең салмактоону камтыйт, мында позициянын чектөөлөрү акырындык менен азайтылып жана жок кылынат, ал эми убакыт кадамы 0,005 psтен 0,02 psке чейин көбөйтүлөт. Тең салмактагандан кийин, ал 0,02 ps убакыт кадамы менен 6 мкс өндүрөт. Emp24 киргизилгенден кийин, системаны минималдаштыруу жана тең салмактоо үчүн ошол эле CHARMM GUI процессин колдонуңуз, андан кийин өндүрүштө 8 секунд иштетиңиз.
Бардык системалар үчүн тең салмактоо процессинде басым Берендсен баростаты (59) менен, ал эми өндүрүш процессинде басым Парринелло-Рахман баростаты (60) менен башкарылат. Бардык учурларда орточо басым 1 барды түзөт жана жарым изотроптук басым бириктирүү схемасы колдонулат. Баланстоо жана өндүрүш процессинде белоктун, липиддик жана эриткич бөлүкчөлөрүнүн температурасын тиешелүү түрдө бириктирүү үчүн ылдамдыкты кайра калибрлөөчү термостат (61) колдонулат. Бүткүл иштөө учурунда максаттуу температура 310К түзөт. Байланышпаган өз ара аракеттенүү 0,005 буфердик толеранттуулук менен Верлет схемасын колдонуп жупташтыруу тизмесин түзүү менен эсептелет. Кулон мүчөсү реакция талаасын жана 1,1 нм кесүү аралыгын колдонуу менен эсептелет. Вандер Ваальс мүчөсү 1,1 нм кесүү аралыгы менен кесүү схемасын колдонот, ал эми Верлет кесүү схемасы потенциалдуу дрейф үчүн колдонулат (62).
VMD колдонуу менен, DOPC фосфат мончоктору же керамид AM1 мончоктору менен белоктун ортосундагы кесилиш толкун узундугу 0,7 нмди түзөт жана белок менен өз ара аракеттенген липиддердин саны эсептелет. Төмөнкү формулага ылайык, (63) сыяктуу азайып-байытуу (DE) коэффициентин эсептегиле: DE фактору = (белоктогу жалпы липиддердин саны 0,7) белоктогу 0,7 (жалпы липиддердеги Cerдин саны)
Көрсөтүлгөн маани орточо маани катары алынат, ал эми ката тилкелери SEнин төрт көз карандысыз көчүрмөсү болуп саналат. DE факторунун статистикалык мааниси t тести [(орточо DE-фактор-1)/SE] менен эсептелет. Бир тараптуу бөлүштүрүүдөн P маанисин эсептеңиз.
GROMACS куралы акыркы 250 н ичинде Emp24 камтыган системанын 2D каптал тыгыздык картасын эсептөө үчүн колдонулган. Керамиддин байытуу/азайтуу картасын алуу үчүн, Cerдин тыгыздык картасы Cer жана DOPC картасынын суммасына бөлүнөт, андан кийин денедеги Cer концентрациясына бөлүнөт. Ошол эле түстүү карта масштабы колдонулат.
Бул макала боюнча кошумча материалдарды көрүү үчүн http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1 дарегине кириңиз.
Бул Creative Commons Attribution-Non-Commercial License шарттары боюнча таратылган ачык жеткиликтүү макала, ал каалаган каражатта колдонууга, таратууга жана көчүрүүгө мүмкүндүк берет, эгерде акыркы колдонуу коммерциялык пайда үчүн болбосо жана түпнуска чыгарма туура болсо. Шилтеме.
Эскертүү: Биз сизден электрондук почта дарегиңизди берүүнү гана суранабыз, ошондо сиз баракчага сунуштаган адам сиз электрондук катты көрүшүн каалаарыңызды жана ал спам эмес экенин билет. Биз эч кандай электрондук почта даректерин кармабайбыз.
Бул суроо сиздин конок экениңизди текшерүү жана спамдын автоматтык түрдө жөнөтүлүшүнүн алдын алуу үчүн колдонулат.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Ана Мариа Перес (Л. Сергиес), Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Муниз
3D жогорку чечилиштеги реалдуу убакыттагы сүрөт тартуу селективдүү чыгаруу жерлеринде белокторду сорттоо үчүн керамид чынжырынын узундугунун маанилүүлүгүн көрсөтүп турат.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиладора Агилера-Ромеро, Ана Мариа Перес (Л. Сергиес), Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Муниз
3D жогорку чечилиштеги реалдуу убакыттагы сүрөт тартуу селективдүү чыгаруу жерлеринде белокторду сорттоо үчүн керамид чынжырынын узундугунун маанилүүлүгүн көрсөтүп турат.
©2020 Илимди өнүктүрүү боюнча Америка Ассоциациясы. бардык укуктар корголгон. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef жана COUNTERдин өнөктөшү. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.