Nature.com сайтына киргениңиз үчүн рахмат. Сиз колдонуп жаткан браузердин версиясында CSS колдоосу чектелүү. Эң жакшы тажрыйба алуу үчүн, жаңыртылган браузерди колдонууну сунуштайбыз (же Internet Explorerде шайкештик режимин өчүрүү). Ошол эле учурда, үзгүлтүксүз колдоону камсыз кылуу үчүн, биз сайтты стилдерсиз жана JavaScriptсиз көрсөтөбүз.
Омурткалуулардан айырмаланып, курт-кумурскаларда эркектерге багытталган жыныстык стероиддик гормондор жетишсиз деп кеңири айтылат. Anopheles gambiaeде экдизон стероиди 20-гидроксиэкдизон (20E) ургаачылары тарабынан синтезделгенде жумуртканын өнүгүшүн көзөмөлдөө жана эркектер тарабынан жыныстык жол менен жугулганда жупташуунун рефрактердик мезгилин пайда кылуу үчүн эволюциялашкан окшойт3. Жумуртканын өнүгүшү жана жупташуу репродуктивдүү өзгөчөлүктөр болгондуктан, ургаачы Anopheles чиркейлеринин бул гормоналдык сигналдарды кантип интеграциялай турганын түшүнүү безгекке каршы күрөшүүнүн жаңы программаларын иштеп чыгууга көмөктөшөт. Бул жерде биз бул репродуктивдүү функциялар экдистероиддерди активдештирүүчү/активдештирүүчү ферменттердин татаал тармагы аркылуу ар кандай жыныстык стероиддер тарабынан жөнгө салынаарын көрсөтөбүз. Биз жыныстык жол менен жугуучудан кийин аялдардын жыныстык кабылдоосун токтотуу жана дефосфорлоо аркылуу активдештирүү менен ата-энени коргогон эркекке мүнөздүү кычкылданган экдизон, 3-дегидро-20E (3D20E) аныктадык. Белгилей кетчү нерсе, 3D20E жугушу Plasmodium инфекциясы учурунда жумуртканын өнүгүшүн колдогон репродуктивдүү гендердин экспрессиясын да индукциялап, жуккан ургаачылардын ден соолугун камсыз кылган. Ургаачылардан алынган 20E... жыныстык реакцияны козгобойт, бирок жупташкан адамдардын 20E-ингибирлөөчү киназалар ингибирленгенден кийин жупташуусуна мүмкүндүк берет. Бул эркекке мүнөздүү курт-кумурска стероиддик гормонунун аныкталышы жана анын аялдардын жыныстык кабылдоосун, төрөттү жана Плазмодий менен өз ара аракеттенүүсүн жөнгө салуудагы ролу безгекти жугузуучу чиркейлердин репродуктивдүү ийгилигин төмөндөтүү мүмкүнчүлүгүн көрсөтүп турат.
Адам безгек мителеринин жалгыз вектору болгон Anopheles чиркейлеринин кеңири таралган инсектициддерге туруктуулугунан улам безгек учурлары жана өлүмдөр кайрадан көбөйүүдө4. Бул чиркейлердин жупташуу биологиясы безгекке каршы күрөшүүнүн жаңы чаралары үчүн өзгөчө жагымдуу бута болуп саналат, анткени ургаачылары бир гана жолу жупташат5; бул бир жупташуу окуясын стерилдештирүү талаадагы чиркейлердин популяциясын азайтууга чоң мүмкүнчүлүк берет.
Аялдар эркектерден жогорку титрлүү стероиддик гормондорду алгандан кийин жыныстык жактан жараксыз болуп калышат. Изилдөөлөр көрсөткөндөй, андан ары жупташуудагы кыйынчылыктардын себеби личинка стадиясындагы эрүү циклинин жөнгө салуучусу катары белгилүү болгон стероиддик гормон болгон 20-гидроксиэкдизон (20E) болуп саналат. Эркектердин 20E синтездөө жана өткөрүп берүү жөндөмү Африкада таралган жана безгектин эң кооптуу векторлорун, анын ичинде Anopheles gambiae камтыган Cellia7 субуруусунун бир бөлүгү болгон Anopheles түрлөрүндө өзгөчө өнүккөн. Бул өзгөчө белгилей кетүүчү нерсе, анткени бул түрлөрдө ургаачылар ар бир кан тапшыруудан кийин 20E өндүрөт жана 20E оогенез циклин башкарат (8-шилтемени караңыз). Бирок, ургаачылар экдизондун эки башка булагынан (эркектин өткөрүп берүүсү жана кан тапшыруу индукциясы) сигналдарды өздөрүнүн жупталуу жөндөмүнө доо кетирбестен кантип интеграциялай тургандыгы жөнүндө аз маалымат бар. Чындыгында, эгер ургаачылар тарабынан өндүрүлгөн 20E жыныстык чыдамсыздыкты жаратса, бул кыздык менен азыктанган адамдарда тукумсуздукка алып келет, бул бул чиркейлерде абдан кеңири таралган жүрүм-турум5.
Мүмкүн болгон түшүндүрмө, A. gambiae эркектери модификацияланган эркекке мүнөздүү экдизонду өткөрүшөт, ал ургаачынын көбөйүү жолунда сигнал берүү каскадын активдештирет, натыйжада жупталуу туруксуздугуна алып келет. Бирок, омурткалууларда эстроген жана андроген сыяктуу бир нече стероиддик гормондор болгону менен (9-шилтемеде каралат), биздин билишибизче, курт-кумурскаларда андрогенге багытталган стероиддер аныкталган эмес.
Биз мүмкүн болгон модификациялоочу стероиддерди издөө максатында жыныстык жактан жетилген A. gambiae эркек эркектин кошумча безиндеги (MAG) стероиддик гормондордун репертуарын аныктоону максат кылдык. Мурда колдонулган анча спецификалык эмес ыкманын ордуна тандем массалык спектрометриясы (HPLC-MS/MS) менен айкалышкан жогорку натыйжалуу суюктук хроматографиясын колдонуп, биз бул ткандан мурунку натыйжаны тастыктадык. Бирок, үлгүдө кычкылданган фосфорланган стероиддер басымдуулук кылган, бул 3-дегидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 формуласына дал келет (1-сүрөт). Башка формаларга 3-дегидро-20E (3D20E) жана 20E-22-фосфат (20E22P) кирет. 3D20E22Pнин HPLC-MS/MS сигналынын интенсивдүүлүгү анын дефосфорланган формасы 3D20Eден эки эсе жогору жана E жана 20Eден үч эсе жогору болгон (1-сүрөт). Бирок, башка бөлүктөрүндө... дене жана төмөнкү көбөйүү тракттары (LRT; Кеңейтилген маалыматтар 1a-сүрөт). Ошондой эле, биз жаңы жабылган (<1 күндүк) эркектердеги жана ургаачылардагы экдистероиддерди талдап, MAGда гана 3D20E жана 3D20E22P аныктадык; E, 20E жана 20E22P эки жыныста тең бар болчу (Кеңейтилген маалыматтар 1b-сүрөт). Бул маалыматтар A. gambiae бойго жеткен эркектери өздөрүнүн MAGларында ургаачылары тарабынан синтезделбеген модификациялоочу гормондордун жогорку титрлерин өндүрөрүн көрсөтүп турат.
MAG жана ургаачы LRT (анын ичинде дүлөйчөлөр, урук көбүкчөлөрү жана пароварий) 4 күндүк (4 күндүк) кыз эркектерден жана кыз жана жупташкан ургаачылардан (0,5, 3 жана 12 л.с.м) бөлүнүп алынган. Бул ткандардагы экдизон HPLC-MS/MS аркылуу талданган (орточо ± сем; жупташпаган t-тест, эки тараптуу, жалган ачылыш ылдамдыгы (FDR) оңдолгон; NS, маанилүү эмес; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 саат vs. 0,5 саат, P = 0,035; 12 саат vs. 3 саат, P = 0,0015; 12 саат vs. 0,5 саат, P = 0,030. 3D20E22P: 3 саат vs. 0,5 саат, P = 0,25; 12 саат vs. 3 саат, P = 0,0032; 12 саат 0,5 саатка салыштырмалуу, P = 0,015). Маалыматтар үч биологиялык кайталоодон алынган. Ар бир кызыктыруучу экдизон үчүн чоку аянты эсептелип, чиркейлердин саны менен нормалдаштырылган. Экдизон төмөнкү түс менен көрсөтүлгөн: E, жашыл; 20E, кызгылт сары; 20E22P, кызгылт көк; 3D20E, көк; 3D20E22P, кызгылт. Киргизилген сүрөт y огундагы масштабды көбөйтүп, экдизондун төмөнкү деңгээлин көрсөтөт.
Жупташуу учурунда 3D20E22P жана 3D20E өткөрүлүп берилеби же жокпу, изилдөө үчүн, биз ургаачы LRTлерди жупташуудан кийинки ар кандай убакыт аралыгында бөлүп алдык. Экдизон кыз балдарда табылбаса да, биз жупташуудан кийин дароо LRTде 3D20E22Pтин олуттуу көлөмүн байкадык (жупташуудан 0,5 саат өткөндөн кийин, ат мин), убакыттын өтүшү менен төмөндөп, ал эми 3D20E деңгээли бир кыйла жогорулаган (1-сүрөт). Химиялык жол менен синтезделген 3D20Eди стандарт катары колдонуп, биз жупташуу LRTлериндеги бул стероиддик гормондун деңгээли 20Eден кеминде 100 эсе жогору экенин аныктадык (Кеңейтилген маалыматтар 1-таблица). Ошентип, 3D20E22P жупташуу учурунда ургаачы LRTге өткөрүлүп берилүүчү негизги эркек экдизон болуп саналат жана анын дефосфорланган формасы, 3D20E, жупташуудан көп өтпөй абдан көп болот. Бул ургаачылардын жупташуудан кийинки биологиясында акыркы экдизондун маанилүү ролун көрсөтүп турат.
Жаңы РНК секвенирлөө (РНК-seq) маалыматтар топтомун түзгөндөн кийин (2a-сүрөт), атайын түзүлгөн биоинформатикалык түтүктү колдонуп, биз экдизон киназасын (EcK), экдизон оксидазасын (EO) жана 20E-модификацияланган фосфатаза генин коддогон экдизонду издедик. EPP) репродуктивдүү ткандарда экспрессияланат. Биз бир талапкер EPP генин жана эки потенциалдуу EcK генин (EcK1 жана EcK2) аныктадык, бирок жакшы талапкер EO генин таба алган жокпуз. Белгилей кетчү нерсе, жеке EPP гендери Гамбиянын MAGларында жогорку деңгээлде (98,9-перцентиль) экспрессияланган, бирок ургаачы LRTлерде эмес (2b-сүрөт), бул биздин күткөнүбүзгө карама-каршы келген, анткени бул ургаачы тканда 3D20E22P депосфорлануу болгон. Ошондуктан, биз эркек EPP жупташуу учурунда берилиши мүмкүн деп эсептейбиз. Чынында эле, биз жупташуудан кийин ургаачы протеинди жашыруу үчүн in vivo туруктуу изотоптук маркировканы колдондук, бул фермент ургаачы дүлөйчөсүндө MS тарабынан аныкталган (сүрөт). 2c жана 1-кошумча таблица). MAG жана жупташкан (бирок таза эмес) ургаачы LRTде EPPнин бар экендиги да белгилүү бир антителолорду колдонуу менен тастыкталган (2d-сүрөт).
а, Ар бир жыныстын репродуктивдик ткандарынан EcK, EO жана EPP коддогон гендерди издөө үчүн атайын курулган биоинформатикалык түтүк. Жебелердин жанындагы сандар ар бир кадамдагы эркек жана ургаачы талапкерлердин санын көрсөтөт. Бул анализ эркектерде экспрессияланган бир EPP генин (EPP) жана бир EcK генин (EcK1), ошондой эле эки жыныста тең экспрессияланган, бирок талапкер EO генин бербеген бир EcK генин (EcK2) аныктады.b, Кыз (V) жана жупташкан (M) Anopheles gambiae жана Anopheles albicans ткандарындагы талапкер гендин экспрессиясын салыштырган жылуулук картасы. Spca, уруктандыруу; MAGs, эркектердеги кошумча бездер; дененин башка бөлүктөрү, анын ичинде эмчектер, канаттар, буттар, майлуу денелер жана эки жыныстагы ички органдар, ал эми аялдардагы энелик бездер. EcK2 Гамбиянын MAG жана дүлөйчөлөрүндө жогорку деңгээлде экспрессияланат, ал эми EPP MAGда гана кездешет.c, Эркектердин эякулят тобунун ургаачы дүлөйчөлөрүнө 3, 12 жана 24 аттын күчүндө транслокациясынын протеомикалык анализи, бул эң көп кездешкен 67 белокту көрсөтөт. Ургаачылар бардык белокторду белгилөө (жана маскалоо) үчүн 15N камтыган диета менен чоңойтулган. Белгиленбеген эркектер белгиленген ургаачылар менен жупташтырылган, ал эми ургаачы LRTлер протеомикалык анализ үчүн 3, 12 жана 24 аттын күчүндө бөлүнүп алынган (эякуляттык белоктордун толук тизмеси үчүн 1-кошумча таблицаны караңыз). Киргизилген, EPP, Eck1 жана EcK2 бул ткандардын протеомикалык анализи аркылуу кыз эркектердин MAGында аныкталган.d, EPP жупташкан ургаачылардын MAG жана LRTде вестерн-блот менен аныкталган, бирок кыз аялдарда же эркектерде же ургаачынын калган бөлүгүндө эмес. дене. Мембраналар бир эле учурда антиактин (жүктөөнү көзөмөлдөө) жана анти-ЭПП антителолору менен изилденген. Бардык эркектер кыз. Гель булагы жөнүндө маалымат алуу үчүн 1-кошумча сүрөттү караңыз. Вестерн-блоттор эки жолу окшош натыйжалар менен жүргүзүлдү.
EPPнин экдистероиддик фосфофосфатаза активдүүлүгү MAGдан бөлүнүп алынган 3D20E22P менен HPLC-MS/MS аркылуу инкубациялангандан кийин текшерилген (Кеңейтилген маалыматтар 2a-сүрөт). Андан тышкары, биз РНК аркылуу интерференция (RNAi) аркылуу EPPди үнсүз кылганда, бул эркектердин репродуктивдик ткандарында фосфатаза активдүүлүгүнүн кескин төмөндөшүн байкадык (3a-сүрөт), ал эми EPP менен үнсүз кылынган эркектер менен жупташкан ургаачылар гендин жарым-жартылай үнсүздөнүшүнө карабастан, дефосфорланган 3D20Eнин (3b-сүрөт) бир кыйла төмөн үлүшүн көрсөтүштү (Кеңейтилген маалыматтар 2b,c-сүрөт). Ал эми, биз ошол эле чиркейлерде 20E22P/20E катышында олуттуу өзгөрүүлөрдү байкаган жокпуз, бул ферменттин 3D20E22P үчүн спецификасы бар экенин көрсөтүп турат (3b-сүрөт).
a, Кош тизмектүү EPP РНКсын (dsEPP) же кош тизмектүү GFP РНКсын (dsGFP) контролдоочу элементтерди колдонуу менен EPP үнсүздөтүүдөн улам MAGдагы фосфатаза активдүүлүгүнүн төмөндөшү. Ар бир кайталоого жыйырма MAG пулу колдонулган (P = 0,0046, жупташкан t-тест, эки тараптуу), өзүнчө чекиттер менен көрсөтүлгөн.b, EPP үнсүздөтүлгөн эркектер менен жупташкан ургаачыларда 3 аттын күчүндө дефосфорланган 3D20Eнин үлүшү бир кыйла төмөн болгон (P = 0,0043, жупташкан эмес t-тест, эки тараптуу), ал эми 20E деңгээлине таасир эткен эмес (P = 0,063, жупташкан эмес). t-тест, эки тараптуу). Маалыматтар ар бири 13, 16 жана 19 ургаачыдан турган үч топтон алынган орточо ± sem катары берилген.c, EPP менен унчукпаган эркектер менен жупташкан ургаачыларда кайра жупташуу көрсөткүчү бир топ жогору болгон (P = 0,0002, Фишердин так тести, эки тараптуу). Ургаачылар жупташуу абалын камсыз кылуу үчүн алгач жупташууга аргасыз болушкан; 2 күндөн кийин, алар трансгендик сперманы алып жүрүүчү башка эркектер менен байланышып, трансгенди сандык ПЦР аркылуу аныктоо аркылуу кайра жупташуу көрсөткүчтөрүн баалашты.d, ЭПП менен унчукпаган эркектер менен жупташкан кан менен азыктанган ургаачылардын төрөт деңгээли бир кыйла төмөндөгөн (P < 0,0001; Манн-Уитни тести, эки тараптуу) жана жумурткалардын саны бир аз азайган (P = 0,088, Манн-Уитни тести, эки тараптуу), ал эми урук чачуу көрсөткүчүнө таасир эткен эмес (P = 0,94, Фишердин так тести, эки тараптуу). Бардык панелдерде n биологиялык жактан көз карандысыз чиркей үлгүлөрүнүн санын билдирет. NS, маанилүү эмес.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Андан кийин, биз экдизондун дефосфорланышы ургаачыларда жупташууга туруктуулукту индукциялоодо маанилүүбү же жокпу, бааладык. Белгилей кетчү нерсе, ЭПП жетишсиз эркектер менен жупташкан ургаачылар кошумча (трансгендик) эркектерге дуушар болгондо контролдук ургаачыларга (10,4%) караганда бир топ жогорку жыштыкта ​​(44,9%) кайрадан жупташкан (3c-сүрөт). Ошондой эле, биз төрөттүн олуттуу төмөндөшүн (3d-сүрөт, солдо) жана бул ургаачылар тарабынан салынган жумурткалардын санынын бир аз азайышын (3d-сүрөт, ортодо) байкадык, ал эми ургаачылар тарабынан салынган жумурткалардын пайызы (ургаачыларда жупташуу аркылуу пайда болгон дагы бир жооп)) жабыркаган жок (3d-сүрөт, оңдо). 3D20E22P үчүн ЭППнын байкалган спецификалуулугун эске алганда, бул жыйынтыктар жупташуу учурунда өткөрүлгөн ЭПП тарабынан 3D20E активдешүүсү ургаачылардын андан ары жупташууга болгон кабылдоосун өчүрүүдө маанилүү ролду ойношу мүмкүн экенин көрсөтүп турат, бул жүрүм-турум мурда 20Eнин жыныстык жол менен берилишине байланыштуу болгон. Ошондуктан, бул эркекке мүнөздүү гормон аялдардын төрөтүнө да күчтүү таасир этет.
Андан кийин, биз химиялык жол менен синтезделген 3D20E (4a–c сүрөт) жана коммерциялык жактан жеткиликтүү 20E колдонулган жыныстык жактан жетилген кыз кыздарга инъекциялык эксперименттерде 20E жана 3D20E активдүүлүгүн салыштырдык. Биз 3D20E эки концентрацияда тең ургаачылардын жупташууга сезгичтигин өчүрүүдө 20Eге караганда бир топ натыйжалуу экенин байкадык (4d сүрөт). Белгилей кетчү нерсе, LRTдеги 3D20E физиологиялык деңгээлинин жарымы (инъекциядан кийин 1066 pg жана жупташтан кийин 2022 pg) инъекциядан 24 саат өткөндөн кийин, жупташтан кийин эң жогорку концентрацияда 18 pg болгондо, 20E физиологиялык деңгээлинен (инъекциядан кийин 361 pg) 20 эсе жогору болгон рефрактердүү ургаачылардын үлүшүн пайда кылды; Кеңейтилген маалыматтар таблицасы 1). Бул жыйынтык 20E жыныстык жол менен жупташуу рефрактердик мезгилдерди пайда кылбайт деген түшүнүккө дал келет жана ата-эне менен баланын ортосундагы мамилени камсыз кылууда 3D20E негизги фактор экенин көрсөтүп турат. 3D20E ошондой эле кыз ургаачылардын жумуртка тууй турган анализдеринде 20Eге караганда бир топ активдүү болгон (4e-сүрөт), бул жарым-жартылай EPP басылгандан кийин байкалган кадимки жумуртка тууй турган ылдамдык жупташуудан улам пайда болгон ургаачы факторлор тарабынан дагы эле өндүрүлгөн калдык 3D20E активдүүлүгүнүн болушуна байланыштуу экенин көрсөтүп турат.
(a,b) 20Eден химиялык жол менен синтезделген 3D20E (a) өтө жогорку конверсия/натыйжалуулук менен (маалыматтар үч көз карандысыз синтез реакциясынан алынган орточо ± sem катары берилген) (b).c, Массалык спектр (төмөнкү жарымы) жупташкан ургаачы LRTде (үстүнкү жарымы) табылган экдизонго (үстүнкү жарымы) дал келет.d, 20E (0.63 мкг, P = 0.02; 0.21 мкг, P < 0.0001; Фишердин так тести, эки тараптуу) жана 10% этанол (0.63 мкг, P < 0.0001; 0.21 мкг, P < 0.0001; Фишердин так тести, 2 тараптуу) менен салыштырганда, ал эми 20E жогорку дозаларда гана (0.63 мкг, P = 0.0002; 0.21 мкг, P = 0.54; Фишердин так тести, 2 тараптуу) контролдук топко караганда бир топ жогору болгон. 3D20E саймасы 10% этанолдуу контролдук топко караганда таза ургаачыларда урук чачуу көрсөткүчүнүн бир кыйла жогору болушуна алып келди (0,21 мкг, P < 0,0001; 0,13 мкг, P = 0,0003; Фишердин так тести, эки тараптуу), ал эми контролдук топко салыштырмалуу 20E жогору дозаларда гана болгон (0,21 мкг, P = 0,022; 0,13 мкг, P = 0,0823; Фишердин так тести, эки тараптуу). 3D20E жогорку дозаларда 20Eге караганда урук чачуу көрсөткүчүнүн бир кыйла жогору болушуна алып келди (0,21 мкг, P = 0,0019; 0,13 мкг, P = 0,075; Фишердин так тести, эки тараптуу). Бардык панелдерде n биологиялык жактан көз карандысыз чиркей үлгүлөрүнүн санын билдирет. NS, маанилүү эмес.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Маалыматтар үч кайталоодон алынган.
Мурунку изилдөөлөрдө биз стероиддик гормондордун жыныстык жол менен берилиши ургаачыларды A. gambiae ургаачыларын P. falciparum инфекциясынан коргогон ургаачы репродуктивдүү ген болгон MISOнун (Оогенездин жупташуу стимулятору 11) экспрессиясын индукциялай турганын аныктаганбыз. Бул гендин экспрессиясын адамдагы эң коркунучтуу безгек митеси болгон 13 келтирет. Безгек эндемиялык аймактарда Анофелестин репродуктивдүү жарамдуулугуна MISOнун маанисин эске алып, биз бул гендин экспрессиясын кайсы 3D20E же 20E гормону козгой турганын аныктоону чечтик. Биз 20E инъекциясы HR3 жана HR4 сыяктуу кээ бир ядролук гормон рецепторлорун (HR) жана Vg14, 15, 16 сыяктуу типтүү төмөнкү стероиддик буталарды атайын же күчтүүрөөк индукциялаганы менен, MISO 3D20E тарабынан күчтүүрөөк индукцияланганын аныктадык (Кеңейтилген маалыматтар 3-сүрөт). Ошентип, бул андрогендик стероиддик гормондун жыныстык жол менен берилиши ургаачыларды мите инфекциясынын чыгымдарынан коргогон механизмдерди индукциялагандай көрүнөт. Андан тышкары, 3D20E эки изоформага тең ар кандай таасир этет. E рецепторунун EcRинин EcR менен байланышы, EcR-A индукциялоо жана EcR-B басуу, ошондой эле аялдардын төрөтүнө таасир этүүчү HPX15 сыяктуу башка жупташууну индукциялоочу гендерди күчтүүрөөк козгойт. Бул EPP менен унчукпаган эркектер менен жупташкан аялдарда байкалган олуттуу тукумсуздукту түшүндүрүшү мүмкүн (Кеңейтилген маалыматтар 3-сүрөт). Бул маалыматтар жыныска мүнөздүү функциянын негизинде жаткан эки экдизон гормону тарабынан артыкчылыктуу түрдө активдештирилген ылдыйкы жолдордун бар экендигин көрсөтүп турат.
Андан кийин, биз биоинформатика түтүгүбүздө аныкталган эки EcK генинин функциясын текшердик. EcK1 же EcK2ни басуу эркектерде олуттуу өлүмгө алып келди (Кеңейтилген маалыматтар 4a-сүрөт), бул экдизондун фосфорланышы жана ошону менен инактивдештирилиши жашоо үчүн маанилүү экенин көрсөтүп турат. EcK2 EcK1ге караганда жогорку деңгээлде экспрессиялангандыктан жана MAGsда протеомика менен аныкталгандыктан (2b,c-сүрөт жана 2-кошумча таблица), биз анын экдистероиддик киназа активдүүлүгүн 20E менен инкубациялоо аркылуу текшердик, бул 20E22P фосфорланышына алып келди (Кеңейтилген маалыматтар 2-сүрөт).4b). 3D20E субстрат катары колдонулганда, биз фосфорланган продукт 3D20E22P аныктай алган жокпуз (Кеңейтилген маалыматтар 4c-сүрөт), бул 3D20E ордуна 20E EcK2нин артыкчылыктуу бута болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Биздин РНК-секвенция анализибизге ылайык, EcK2 кыз ургаачылардын LRT'сүндө да жогорку деңгээлде экспрессияланган, ал жерде жупташкандан кийин өчүрүлгөн (2b-сүрөт). Биз бул маалыматтарды тастыктап, EcK2 экспрессиясына кан менен тамактандыруу таасир этпегенин аныктадык (Кеңейтилген маалыматтар 5a-сүрөт). Баштапкы MS эксперименттерибизди кеңейтип, биз 20E22P чокусу 20E чокусу менен тыгыз байланышта экенин аныктадык (кан менен тамактангандан кийин 22-26 саат; Кеңейтилген маалыматтар 5b-сүрөт). Кыз ургаачыларда EcK2нин унчукпай калышы кан менен тамактангандан кийин 26 сааттан кийин 20E менен 20E22Pнин салыштырмалуу катышынын 3 эсеге жогорулашына алып келди (Кеңейтилген маалыматтар 2c жана 5c сүрөттөрү), бул EcK2 ургаачыларда 20E фосфорлой турганын тастыктайт. Белгилей кетчү нерсе, EcK2 жетишсиз кыз ургаачыларда толук жыныстык кабылдоону сактап калган (Кеңейтилген маалыматтар 5d,e сүрөтү), бул ургаачыларда 20E өндүрүшү жупташууну пайда кылбай турганын көрсөтүп турат. рефрактердик мезгилдер. Бирок, бул ургаачылардын жумуртка салуу көрсөткүчү контролдук топко салыштырмалуу бир топ жогорулаган, кыз аарылардын 30% дан ашыгы жумуртка туушкан (Кеңейтилген маалыматтар 5-сүрөт, f). Эгерде кан менен азыктангандан кийин кош тизмектүү Eck2 РНК (dsEcK2) саймалары жасалса, урук таштоо болгон эмес, ал учурда кан менен азыктангандан улам 20E чокусу төмөндөгөн. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар кан соргондон кийин пайда болгон 20E урук таштоону пайда кыла алат деген моделди колдойт, бирок урук таштоону блоктоо (EcK2 жана, балким, башка факторлор) жупташуу менен өчүрүлгөндө гана. 20E да, 3D20E саймалары да кыз аарыларда EcK2 экспрессиясын баскан эмес (Кеңейтилген маалыматтар 5g-сүрөт, бул башка факторлор бул киназанын ингибирленишине ортомчулук кылаарын көрсөтүп турат. Бирок, кан менен азыктангандан кийинки 20E деңгээли жупташуудагы ыңгайсыздыкты пайда кылуу үчүн жетиштүү болгон эмес, бирок жыныстык жол менен жугуучу 3D20Eнин жогорку титрлери менен натыйжалуу түрдө козголгон.
Биздин жыйынтыктар A. gambiae көбөйүү ийгилигин жөнгө салуучу механизмдер жөнүндө маанилүү түшүнүктөрдү берет. Эркектер ургаачылардын андан ары жупташууга сезимталдыгын төмөндөтүү менен ата-энеликти камсыз кылган эркекке мүнөздүү модификацияланган экдизон болгон 3D20E жогорку титрлерин синтездөө үчүн эволюциялашкан модель пайда болду. Ошол эле учурда, бул безгек векторлору эркекке мүнөздүү EPP жыныстык жол менен берилишине жооп катары ургаачыларда 3D20Eди активдештирүү үчүн натыйжалуу системаны иштеп чыгышты. Биздин билишибизче, бул курт-кумурскаларда уникалдуу жана маанилүү функцияны аткарган эркек жана ургаачы үстөмдүк кылган стероиддик гормон системасынын биринчи мисалы. Эркекке мүнөздүү экдизон функциясы божомолдонгон, бирок так көрсөтүлгөн эмес. Мисалы, негизинен четке кагылган гипотеза 18 - бул функцияларды 20E прекурсору E1 аткарышы мүмкүн. Дрозофилада моандрия белгилүү бир жыныстык пептид рецепторлору аркылуу ургаачынын көбөйүү жолун нервдештирүүчү нейрондор менен өз ара аракеттенген кичинекей жыныстык пептиддердин19,20 жыныстык жол менен берилиши менен ишке ашаары белгилүү21,22. Аныктоо үчүн андан ары иш алып баруу талап кылынат A. gambiae ургаачыларында 3D20E тарабынан башкарылуучу ылдыйкы агымдагы сигнал берүү каскаддары жана бул каскаддардын чиркейлер менен дрозофиланын ортосунда сакталып калышы мүмкүнбү же жокпу, аныктоо.
Биздин изилдөөдө аныкталган 3D20Eнин ургаачылардын төрөтүнө жана жүрүм-турумуна маанилүү ролун эске алганда, 3D20E синтезине жана активдешүүсүнө алып баруучу жолдор келечектеги чиркейлерди көзөмөлдөө стратегиялары үчүн жаңы мүмкүнчүлүктөрдү сунуштайт, мисалы, стерилдүү курт-кумурскалардын технологиялык стратегияларында атаандаштыкка жөндөмдүү стерилдүү эркектерди пайда кылуу. Жапайы кое берүү же 3D20Eни кыздык оюнда туурап колдонуу. 3D20Eнин эркекке мүнөздүү функциясы A. gambiae жана башка Cellia түрлөрү уруктарын жупташуу тыгындарына айландыруу жөндөмүнө ээ болгондо өнүккөн болушу мүмкүн, анткени бул көп сандагы гормондорду жана гормондорду активдештирүүчү ферменттерди натыйжалуу өткөрүп берүүгө мүмкүндүк берет. Өз кезегинде, монандрияны ишке ашырган 3D20E эволюциясы ургаачыларга (MISOнун жогорку экспрессиясы аркылуу) безгектин көп тараган аймактарында репродуктивдүү фитнесин колдоо механизмин камсыз кылат, бул кыйыр түрдө Плазмодийдин жугушуна салым кошот. Ургаачы 20E Anopheles чиркейлеринде P. falciparumдун жашоого жана өсүшүнө терең таасир этери көрсөтүлгөнүн эске алганда,24 эркек жана ургаачы стероиддик гормон жолдору азыр чиркей-мите өз ара аракеттенүүсүнүн негизги аспектилери болуп саналат.
A. gambiae G3 штаммдары стандарттуу курт-кумурскалар шарттарында (26-28 °C, 65-80% салыштырмалуу нымдуулук, 12:12 саат жарык/караңгы фотопериод) багылган. Личинкалар балыктын порошок түрүндөгү жеми менен (TetraMin тропикалык кабырчыктары, Кой гранулдары жана Tetra көлмө таякчалары 7:7:2 катышында) азыктанган. Чоң чиркейлерге 10% декстроза эритмеси жана жума сайын адамдын каны берилген (кандын компоненттерин изилдөө). Кыз чиркейлер учтарын микроскопия аркылуу текшергенден кийин куурчакча стадиясында жыныстарын бөлүү жолу менен алынган. DsRed трансгенин алып жүрүүчү эркектер мурда сүрөттөлгөн.
Мажбурлап жупташуу эксперименттери мурда сүрөттөлгөн протоколдорго ылайык жүргүзүлдү. Табигый жупташуу үчүн 4 күндүк кыз ургаачылар жыныстык жактан жетилген кыз эркектер менен 1:3 катышында эки түн кармалган. Эркектерге dsEPP сайылган эксперименттер үчүн, биргелешип капаска камоо инъекциядан кийинки 3-4-күндөргө дал келген, бул учурда фосфатазанын активдүүлүгү максималдуу түрдө басылган (Кеңейтилген маалыматтар 2b-сүрөт).
Чиркей ткандары, калган өлүктөр (дененин калган бөлүгү) же бүт дене 100% метанолго бөлүнүп, мончок менен гомогендештирилген (2 мм айнек мончоктор, 2400 айн/мин, 90 сек). Ткандардын көлөмү жана метанолдун көлөмү төмөнкүдөй болгон: дененин калган бөлүгү, 1000 мклде 50; MAG, 50–100 80 мкл; ургаачы LRT, 25–50 80 мкл. Чөкмө ошол эле көлөмдөгү метанол менен экинчи метанол экстракциясына дуушар болгон. Клетка калдыктары центрифугалоо жолу менен алынып салынган. Эки экстракциядан тең алынган метанол бириктирилип, азот агымы астында кургатылган, андан кийин суудагы 80% метанолдун төмөнкү көлөмдөрүндө кайра эритилген: дененин калган бөлүгү, 50 мкл; MAG жана ургаачы LRT, 30 мкл.
Үлгүлөр LC инструментине (Vanquish, Thermo Fisher) туташтырылган массалык спектрометрде (ID-X, Thermo Fisher) талданган. 25 °C температурада кармалып турган 3 мкм, 100 × 4,6 мм тилкеге ​​(Inspire C8, Dikma) 5 мкл үлгү куюлган. LC үчүн кыймылдуу фазалар A (суу, 0,1% кумурска кислотасы) жана B (ацетонитрил, 0,1% кумурска кислотасы) болгон. LC градиенти төмөнкүдөй болгон: 1 мүнөткө 5% B, андан кийин 11 мүнөттүн ичинде 100% B чейин көбөйтүлгөн. 100% температурада 8 мүнөттөн кийин тилкени 5% B температурада 4 мүнөт кайра тең салмактаңыз. Агым ылдамдыгы 0,3 мл мин-1 болгон. MS булагындагы иондоштуруу оң жана терс режимдерде ысытылган электроспрей иондоштуруу аркылуу ишке ашырылат.
Массалык спектрометр толук MS режиминде 60 000 чечилиште 350дөн 680ге чейинки m/z диапазонундагы маалыматтарды өлчөйт. MS/MS маалыматтары [M + H]+ (бардык буталарга), [M - H2O + H]+ (бардык буталарга) жана [M - H]- (фосфорланган буталарга) боюнча алынган. MS/MS маалыматтары эч кандай стандарт жок буталардын экдизон касиеттерин ырастоо үчүн колдонулган. Максаттуу эмес экдистероиддерди аныктоо үчүн, салыштырмалуу көптүгү >15% болгон бардык HPLC чокулары үчүн MS/MS маалыматтары талданган. Бир белгилүү үлгүнүн (башка бардык буталардын) абсолюттук көлөмүн же суюлтууларын эсептөө үчүн таза стандарттардан (20E, 3D20E) түзүлгөн стандарттык ийри сызыктарды колдонуп, алардын бир эркекте табылган өлчөмдөргө эквиваленттүүлүгүн эсептөө үчүн сандык баалоо жүргүзүлдү. 3D20E үчүн сандык баалоо төмөнкү аддукттардын суммасын колдонуу менен жүргүзүлдү: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Маалыматтар Tracefinder (4.1 версиясы) аркылуу алынып, сандык жактан аныкталган. MS/MS маалыматтары Xcalibur (4.4 версиясы) аркылуу талданган. E, 20E жана 3D20E MS спектрлери тиешелүү стандарттар менен салыштырылган. 3D20E22P Жирар реактиви менен дериватизациялоо жолу менен талданган. 20E22P m/z катышы менен талданган.
3D20E22P MAGдан тазаланган. Тазалоо HPLC-MS/MS анализи менен бирдей LC шарттарында квадруполдук массага негизделген детектору (QDa, Acquity, Waters) бар ультра натыйжалуу суюк хроматографты (Acquity, Waters) колдонуу менен аналитикалык масштабда жүргүзүлдү. 3D20E22Pге туура келген m/z мурда аныкталгандай эле кармоо убактысында аныкталганда фракция чогултуу ишке киргизилди. Андан кийин алынган кошулмалардын тазалыгы жогоруда сүрөттөлгөндөй HPLC-MS/MS менен текшерилди.
Жалпы РНК 10-12 репродуктивдүү ткандардан же дененин башка бөлүктөрүнөн (башсыз) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык TRI реагентин (Thermo Fisher) колдонуу менен алынган. РНК TURBO DNase (Thermo Fisher) менен иштетилген. кДНК өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык Молоней чычкан лейкемия вирусунун тескери транскриптазасын (M-MLV RT; Thermo Fisher) колдонуу менен синтезделген. Тескери транскрипция үчүн сандык ПЦР (RT-qPCR; Кеңейтилген маалыматтар таблицасы 2) үчүн праймерлер мурда жарыяланган24 же Primer-BLAST26 колдонуу менен иштелип чыккан, өлчөмү 70-150 б.п. болгон жана экзон-экзон түйүндөрүн камтыган же Primer жуп праймерлерин өзүнчө экзондорго артыкчылык берилген. Үчтөн төрткө чейинки биологиялык кайталоолордон алынган кДНК үлгүлөрү RT-qPCR үчүн сууда төрт эсе суюлтулган. Сандык аныктоо 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймерлерди жана 5 мкл суюлтулган кДНКны камтыган 15 мкл кайталоо реакцияларында жүргүзүлдү. Реакциялар ... QuantStudio 6 Pro реалдуу убакыттагы ПЦР системасы (Thermo Fisher) жана маалыматтар Design and Analysis (2.4.3 версиясы) аркылуу чогултулуп жана талданган. Бул изилдөөдө көрсөтүлгөндөй, салыштырмалуу өлчөмдөр RpL19 рибосомалык генине (AGAP004422) нормалдаштырылган, анын экспрессиясы кан менен азыктанганда 27 же жупташуу 3 менен олуттуу өзгөргөн эмес.
РНКнын сапаты Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent) колдонуу менен текшерилген. Illumina жупташкан учтуу китепканалары MITтин Брод институтунда жана Гарвардда даярдалып, иштетилген. Ырааттуулук менен окуулар HISAT2 (2.0.5 версиясы) аркылуу демейки параметрлер менен A. gambiae геномуна (PEST штаммы, 4.12 версиясы) шайкеш келтирилген. Карталоо сапаты (MAPQ) упайлары <30 болгон окуулар Samtools (1.3.1 версиясы) аркылуу алынып салынган. Гендерге карталанган окуулардын саны демейки параметрлер менен htseq-count (0.9.1 версиясы) аркылуу эсептелген. Нормалдаштырылган окуулардын саны эсептелген жана R (4.0.3 версиясы) тилиндеги DESeq2 пакетин (1.28.1 версиясы) колдонуп дифференциалдык ген экспрессиясы талданган.
Экдизонду модификациялоочу гендин талапкерлери алгач A. gambiae геномун PSI-BLAST алгоритмин (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) колдонуп, демейки маанилерди колдонуп, төмөнкү суроо белок ырааттуулугу бар параметрлерди издөө менен аныкталган: Bombyx mori (Мурунку номер NP_001038956.1), Musca domestica (Мурунку номер XP_005182020.1, XP_005175332.1 жана XP_011294434.1) жана Microplitis demolitor (Мурунку номер XP_008552646.1 жана XP_008552645.1) B. mori (Мурунку номер NP_001036900), Drosophila melanogaster (Мурунку номер NP_651202) EcK, Apis mellifera (милдеттенме № XP_394838) жана Acyrthosiphon pisum (милдеттенме № XP_001947166); жана B. moriден алынган EPP (милдеттенме № XP_001947166) NP_001177919.1 жана NP_001243996.1) жана D. melanogasterдин EOсу (милдеттенме № NP_572986.1) (1-кадам). Андан кийин, Гамбиядагы репродуктивдүү ткандагы (ургаачы LRT же MAG) жогорку мРНК экспрессиясына (миллион картага түшүрүлгөн окууга >100 фрагмент/килобазалык экзондорго (FPKM) же >85%) негизделген чыпкалоо хиттери (2-кадам). Спецификалуулукту жакшыртуу үчүн, биз жупташуу учурунда экдизонду синтездебеген же өткөрбөгөн анофел түрүнүн A. albimanus репродуктивдүү тканында да экспрессияланган талапкер ферменттерди тандап алдык. Кандидат гендер A. albimanus репродуктивдүү тканындагы төмөн экспрессияга (<100 FPKM же <85-перцентиль) негизделип чыпкаланган (3-кадам). Акыркы чыпка катары (4-кадам), талапкер гендер төмөнкүлөрдүн жок дегенде бирин канааттандырышы керек: (1) дифференциалдуу экспрессияланган гендердин анализине ылайык, жупташуудан кийин бир кыйла жогорулаган (P < 0,05) жана (2) репродуктивдүү эмес ткандарда (< 85 % же <100 FPKM).
Биз мурда сүрөттөлгөн 28, 29, 30 ыкмаларды өзгөртүп, бүтүндөй организмди изотоптук этикеткалоону ишке ашырдык. Кыскача айтканда, жапайы типтеги Saccharomyces cerevisiae II типтеги (YSC2, Sigma) азоттун жалгыз булагы катары (салмак/көлөм) 2% глюкозаны (G7528, Sigma), 1,7% аминокислотасыз жана аммоний сульфатын камтыган ачыткы азот негизинде (BD Difco, DF0335) жана 5% 15N аммоний сульфатын (NLM-713, >99%, Кембридж изотоп лабораториялары) сынап көрдүк. Ачыткы центрифугалоо жолу менен алынып, чиркей личинкалары куурчакчага айланганга чейин эркин берилчү. Төртүнчү куракта өлүмдүн алдын алуу үчүн балык уну менен кошумча азыктандырылган (300 личинкага 0,5 мг). Андан кийин жупташуу учурунда өткөрүлгөн эркек протеомду талдоо үчүн этикеткаланбаган эркектер менен жупташуу эксперименттеринде ургаачылары гана колдонулган.
4-6 күндүк 15N-белгиленген кыз ургаачылары жашы боюнча дал келген, белгиленбеген кыз эркектер менен жупташууга аргасыз болушкан. Ийгиликтүү жупташуу эпифлуоресценциялык микроскопия астында жупташуу тыгындарын аныктоо менен текшерилген. 3, 12 жана 24 аттын күчү менен 45-55 жупташкан ургаачыларынын дүлөйчөлөрү 50 мкл аммоний бикарбонаты буферине (рН 7,8) бөлүнүп, пестле менен гомогендештирилген. Гомогенат центрифугаланып, үстүнкү катмар 50 мМ аммоний бикарбонатында 50 мкл 0,1% RapiGest (186001860, Уотерс) менен аралаштырылган. Ар бир үлгүдөн алынган үстүнкү катмар жана гранула кургак музда тоңдурулуп, түн ичинде Вашингтон университетинин MacCoss лабораториясына жөнөтүлгөн, ал жерде LC-MS/MS үчүн үлгү даярдоо аяктаган. Гранулду 50 мкл 0,1% RapiGest 50 мМ аммонийде кайра эритиңиз. Суу мончосунда бикарбонат жана ультраүндүү кислота. Түйүлдүктүн жана үстүнкү катмардын белок концентрациясы BCA анализи менен өлчөнгөн, үлгүлөр 5 мМ дитиотреитол (DTT; Sigma) менен калыбына келтирилген, 15 мМ йодоацетамид (Sigma) менен алкилденген жана 37 °C (1:0 50) температурада 1 саат бою трипсиндештирүү менен инкубацияланган: трипсин: субстрат катышы). RapiGest 200 мМ HCl кошуу менен лизистелген, андан кийин 37 °C температурада 45 мүнөт инкубацияланган жана калдыктарды кетирүү үчүн 4 °C температурада 10 мүнөт бою 14 000 айн/мин ылдамдыкта центрифугаланган. Үлгүлөр кош режимдеги катуу фазалуу экстракция (Oasis MCX картридждери, Waters) менен жуулган жана 0,1% кумурска кислотасында кайра эритилип, 0,33 мкг мкл-1 акыркы белок концентрациясы алынган. Белгисиз MAG протеомдору да ушундай эле таза абалдан анализденген. эркектер. Ар бир үлгү үчүн эки аналитикалык кайталоо талданган. Андан кийин, ар биринен 1 мкг Jupiter C12 тескери фазалуу чайыры (Phenomenex) менен толтурулган 4 см эритилген кремний Kasil1 (PQ) фрит тузак менен 25 см эритилген кремний 75 мкм колонка жана 180 мүнөттүк суюк хроматография аркылуу талданган. Үлгү дайджесттери – MS/MS Q-Exactive HF массалык спектрометринде (Thermo Fisher) nanoACQUITY UPLC системасы (Waters) менен иштетилген. Ар бир иштетүү үчүн түзүлгөн маалыматтарга байланыштуу чогултуу маалыматтары Proteowizard (3.0.20287 версиясы) жана Comet31 (3.2 версиясы) аркылуу Anopheles gambiae (VectorBase версиясы 54), Anopheles coluzzi белок ырааттуулугун камтыган FASTA маалымат базасына каршы mzML форматына айландырылган. Mali-NIH (VectorBase версиясы 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021-жылдын марты), A. gambiae РНК-seq жана белгилүү адам булгоочу заттардын үч кадрлык которуулары боюнча издөө жүргүзүлдү. Пептиддик картага дал келген FDRлер Percolator32 (3.05 версиясы) аркылуу 0.01 босогосу менен аныкталган жана пептиддер Limelight33 программасында белоктун парсимониясын колдонуп белокторду идентификациялоого чогултулган. (2.2.0 версиясы). Салыштырмалуу белоктун көптүгү мурда сүрөттөлгөндөй ар бир циклдеги ар бир белок үчүн эсептелген нормалдаштырылган спектрдик көптүк коэффициентин (NSAF) колдонуу менен бааланган. Ар бир белокко салыштырмалуу NSAF эки башка биологиялык кайталоолордон алынган үлгүлөр боюнча орточо эсептелген. 15N белгилөө ургаачы протеомду ийгиликтүү жашырган, бирок белгиленген кыз балдардан аз өлчөмдөгү белгиленбеген белокту аныктоого мүмкүн болгон. Биз ургаачы чийки үлгүлөрдө эркек белоктун азайышынын (1-5 спектр) аныкталышын техникалык циклдерде гана каттадык, мында чийки үлгүлөр эркек/жупташкан үлгүлөрдөн кийин HPLC "алып өтүүнүн" натыйжасында жүргүзүлдү. Белгиленген кыз балдардан "булгоочу заттар" катары табылган кээде белоктор 1-кошумча таблицада келтирилген.
Genscriptтеги эки антигендик пептид, QTTDRVAPAPDQQQ (PA изотипинин ичинде) жана MESDGTTPSGDSEQ (PA жана PB изотипинин ичинде). Эки пептид бириктирилип, андан кийин KLH ташуучу протеин менен конъюгацияланып, Жаңы Зеландия коёндоруна сайылган. Төртүнчү сайылгандан кийин коёндор союлуп, жалпы IgG аффиндик тазалоо жолу менен бөлүнүп алынган. Эң көп EPPге мүнөздүү коёндон алынган IgG андан ары вестерн-блоттоо үчүн колдонулган.
Вестерн блоттору үчүн, 4 күндүк кыз эркектерден жана кыз же мажбурлап жупташкан ургаачылардан алынган MAG (n = 10, мында n биологиялык жактан көз карандысыз чиркей үлгүлөрүнүн санын билдирет) жана ургаачы LRT (n = 30) (жупташуудан кийинки <10), белокту экстракциялоо буфери (50 мМ Трис, рН 8.0; 1% NP-40; 0.25% натрий дезоксихолат; 150 мМ NaCl; 1 мМ EDTA; 1× протеаза ингибиторунун коктейли (Roche)) өзүнчө кошулган. Үлгүлөр мончок менен (2 мм айнек мончоктор, 2400 айн/мин, 90 сек) диссекциядан кийин дароо гомогендештирилген. Эрибеген калдыктар 20 000 г ылдамдыкта 4°C температурада центрифугалоо аркылуу алынып салынган. Белоктор Брэдфорд анализи (Bio-Rad) менен сандык жактан аныкталган. Андан кийин 20 мкг MAG белок, 40 мкг LRT белок жана 20 мкг Калдык протеин денатурацияланып, MOPS буферин колдонуу менен 10% Bis-Tris NuPAGE менен бөлүнгөн. Протеиндер iBlot2 которуу системасын (Thermo Fisher) колдонуу менен поливинилиден фторид мембраналарына өткөрүлгөн. Мембраналар 1× PBS-Tде эки жолу жуулган (PBSте 0,1% Tween-20), андан кийин Odyssey бөгөттөөчү буферинде (Li-Cor) 22°C температурада 1 саат бою бөгөттөлгөн. Мембраналар 4°C температурада түнү бою коёндун атайын EPPге каршы поликлоналдык баштапкы антителосу (бөгөттөөчү буферде 1:700) жана келемиштин актинге каршы моноклоналдык баштапкы антителосу MAC237 (Abeam; 1:4,000) менен чайкалган. Мембраналар PBS-T менен жуулган, андан кийин 0,01% SDS жана 0,2% Tween -20 эритмесин 22 °C температурада 1 саатка кармадык. Кабыкчалар PBS-T менен жуулуп, Odyssey CLx сканери менен сүрөткө тартылды. Сүрөттөр Image Studio программасында чогултулуп, иштетилди (5.2 версиясы). EPP-RA изоформасына (82 кДа) туура келген белгилүү бир тилке аныкталган жок.
EPP (гистидин фосфатаза доменин камтыган AGAP002463-RB изоформасы катары, NCBI сакталган домен издөө 34) жана EcK2 (AGAP002181) коддоо аймактары pET-21a(+) плазмидине (Novagen Millipore Sigma) клондолгон; праймерлер кеңейтилген маалыматтардын 2-таблицасында келтирилген. pET-21a(+)-EcK2 конструкциясынын С-терминалынын 6xHis тегинин алдына сегиз GS4 байланыштыргычы (тандем менен) киргизилген. Рекомбинанттык белоктор NEBExpress клеткасыз E. coli белок синтези реакциясын (New England BioLabs) колдонуу менен өндүрүлгөн. Рекомбинанттык белоктор NEBExpress Ni спин колонкаларын (New England BioLabs) колдонуу менен тазаланган. Дигидрофолат редуктаза (DHFR) башкаруу белок NEBExpress клеткасыз E. coli белок синтези комплектинен ДНК шаблонун колдонуу менен өндүрүлгөн. Белоктор PBSте 50% глицеринде -20 °C температурада 3 айга чейин сакталган.
ЭППнын жана ткань экстракттарынын фосфатаза активдүүлүгү 4-нитрофенилфосфат (pNPP; Sigma-Aldrich) колдонуу менен өлчөнгөн. Реакция буферинде 25 мМ Трис, 50 ​​мМ уксус кислотасы, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА жана 1 мМ ДТТ болгон. Ткань реакция буферинде гомогендештирилген жана клетка калдыктары центрифугалоо жолу менен алынып салынган. 2,5 мг мл-1 pNPP камтыган реакция буферине фермент же ткань экстракт кошуу менен реакцияны баштаңыз. Реакция аралашмасы бөлмө температурасында караңгыда инкубацияланган, ал эми pNPPден айландырылган pNPнин көлөмү ар кандай убакта 405 нмде абсорбцияны өлчөө менен сандык жактан аныкталган.
In vitro EcK активдүүлүгү үчүн, белок 200 мкл буферде (рН 7.5) 0.2 мг 20E же 3D20E менен 10 мМ HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 мМ ATP жана 10 мМ MgCl2 камтыган 200 мкл буферде (рН 7.5) 27°C температурада 2 саат бою инкубацияланган. Реакция 800 мкл метанол кошуу менен токтотулган, андан кийин -20°C температурада 1 саат муздатылган, андан кийин 20 000 г температурада 4°C температурада 10 мүнөт центрифугаланган. Андан кийин үстүнкү катмар HPLC-MS/MS ыкмасы менен талданган. Контролдук топто колдонулган белокторду жылуулук менен инактивдештирүү үчүн, белоктор PBSте 50% глицеринде 95°C температурада 20 мүнөт инкубацияланган.
In vitro EPP активдүүлүгү үчүн, белок 25 мМ Трис, 50 ​​мМ уксус кислотасы, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ EDTA жана 1 мМ DTT камтыган 100 мкл буферде (рН 7,5) 3D20E22P (HPLC-MS/MS менен тазаланган 18 жуп MAGда табылган өлчөмгө барабар) менен 27°C температурада 3 саат бою инкубацияланган. Реакция 400 мкл метанол кошуу менен токтотулуп, -20°C температурада 1 саат бою муздатылган, андан кийин 20 000 г температурада 4°C температурада 10 мүнөт центрифугаланган. Супернатант HPLC-MS/MS менен талданган.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) жана EcK2 (556 bp) үчүн ПЦР фрагменттери аралаш жыныстагы башсыз чиркей өлүктөрүнөн даярдалган кДНКдан күчөтүлдү. eGFP контролунун ПЦР фрагменти (495 bp) мурда сүрөттөлгөн pCR2.1-eGFPден күчөтүлдү; ПЦР праймерлери Кеңейтилген Маалыматтар Таблицасы 2де келтирилген. ПЦР фрагменти pL4440 плазмидасында тескери Т7 промоторлорунун ортосуна киргизилген. Плазмиддик конструкциялар NEB 5-α компетенттүү E. coli (New England Biolabs) дан алынып, колдонуудан мурун ДНК секвенирлөөсү менен текшерилген (киргизүү ырааттуулугу үчүн Кошумча Маалыматтарды 1 караңыз). T7 промоторуна дал келген праймерлер (Кеңейтилген Маалыматтар Таблицасы 2) pL4440 негизиндеги плазмидден киргизилгенди күчөтүү үчүн колдонулган. ПЦР продуктунун өлчөмү агароза гелинин электрофорези менен тастыкталган. dsРНК ПЦР шаблондорунан Megascript T7 транскрипция комплектин (Thermo Fisher) колдонуп транскрипцияланган жана мурда сүрөттөлгөн өзгөртүүлөр менен өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык тазаланган.
dsRNA сайуу үчүн, эклозиядан кийин 1 күндүн ичинде бойго жеткен эркектердин же ургаачылардын (Nanoject III, Drummond) көкүрөгүнө 10 нг nl-1 концентрациясында 1380 нг dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) сайылган. Гендердин нокдаун деңгээли кеминде үч биологиялык репликада РНК экстракциясы, кДНК синтези жана RT-qPCR аркылуу аныкталган. Экдизон сайуу үчүн, 4 күндүк кыз же 6 күндүк кыз кан менен азыктанган ургаачыларга эксперименталдык дизайнга жараша 1,3, 2,1 концентрациясында 0,13, 0,21 же 0,63 мкг 20E же 3D20E (Nanoject III, Drummond) сайылган. 10% (көлөм/көлөм) 100 нл сайыңыз. суудагы этанол; 10% этанолдогу 100 нл 3D20E22P (MAG жубунда табылган көлөмдүн 75% га барабар). Чиркейлер инъекциялык топко кокустук түрдө бөлүштүрүлдү.
Ургаачы чиркейлердин урук чачуу анализдери үчүн, 3 күндүк ургаачылары адамдын каны менен эркин тамактандырылган. Жарым-жартылай жеген же жебеген чиркейлерди алып салыңыз. Дарылоого жараша, ургаачылары кан менен тамактангандан кийин кеминде 48 саат бою төрт түн бою өзүнчө урук чачуучу чөйчөктөргө салынып турду. Жумурткалар стереоскоп (Stemi 508, Zeiss) астында саналган; жупташкан ургаачылары үчүн личинкаларга айланган жумурткалар тукумдуу деп эсептелген.
Жупташуу сыноолору үчүн ургаачылар жупташууга туруктуулук пайда болушу үчүн дарылоого жараша кеминде 2 күн убакыт берилген, ал эми жапайы типтеги жашы дал келген эркектер кийин ошол эле капаска киргизилген. Эки түндөн кийин ургаачы ургаачы көбүкчөлөр бөлүнүп алынып, геномдук ДНК 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ EDTA жана 25 мМ NaCl (рН 8.2) камтыган буферде тоңдуруу-эритүү жана ультраүн менен иштетүү жолу менен чыгарылган. Үлгүлөр протеиназа К (0.86 мкг мкл-1) менен 55 °C температурада 15 мүнөт, андан кийин 95 °C температурада 10 мүнөт инкубацияланган. Чийки геномдук ДНК препараттары 10 эсе суюлтулуп, Y хромосомасынын ырааттуулугун qPCR менен аныктоого дуушар болгон; праймерлер кеңейтилген маалыматтардын 2-таблицасында келтирилген. Y хромосомасынын ырааттуулугунун жоктугу жупташуунун жоктугун билдирет.
Кайра жупташтыруу анализдери үчүн, мажбурлап жупташкан ургаачылар жупташуунун абалын ырастоо үчүн жупташуу тыгындарынын бар-жогун текшерип, мурда сүрөттөлгөндөй 36 эркектер жок болгондо жупташууга туруктуулукту өнүктүрүү үчүн 2 күн убакыт берилген. Андан кийин DsRed трансгендик спермасын алып жүрүүчү эркектер ургаачы капастарга киргизилген. Эки түндөн кийин ургаачылардан уруктандыруучу көбүкчөлөр бөлүнүп алынып, геномдук ДНК жогоруда сүрөттөлгөндөй даярдалып, DsRed трансгенин qPCR аркылуу аныктоого дуушар болгон; праймерлер Кеңейтилген маалыматтар таблицасында 2-тизмеде келтирилген. DsRed трансгенинин жоктугу кайра жупташуу болбогонун көрсөткөн.
3D20E мурда сүрөттөлгөндөй синтезделген 37. Кыскача айтканда, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) 10 мл сууда эриген, андан кийин 30 мг платина карасы (порошок түрүндө, Sigma-Aldrich) кошулган. Реакциялык аралашмага O2нин жумшак агымы тынымсыз көбүктөнүп, бөлмө температурасында аралаштырылган. 6 сааттан кийин реакцияны токтотуу үчүн 30 мл метанол кошулган. Аралашма катализатор бөлүкчөлөрүн алып салуу үчүн центрифугаланган. Үстүнкү катмар бөлмө температурасында вакуумда кургаганга чейин бууландырылган. Кургатылган реакция продуктусу HPLC-MS/MS анализи үчүн инъекция үчүн 10% этанолдо жана метанолдо эриген. Конверсия ылдамдыгы (20Eден 3D20Eге чейин) болжол менен 97% түзгөн (4b-сүрөт), ал эми синтезделген 3D20Eнин MS спектри жупташкан ургаачыларда кездешкен спектрге дал келген (4c-сүрөт).
Легендада жүргүзүлгөн статистикалык тесттердин конкреттүү маалыматтары камтылган. Фишердин так тестин, Мантел-Кокс тестин жана Студенттин t-тестин аткаруу үчүн GraphPad (9.0 версиясы) колдонулган. Кокран-Мантел-Хензел тесттери R скриптин колдонуу менен жүргүзүлдү (https://github.com/duopeng/mantelhaen.test дареги боюнча жеткиликтүү). Маалыматтардын бөлүштүрүлүшү Шапиро-Уилк тестин колдонуу менен нормалдуулукка 0,05 маанилик босогосу менен текшерилген. Маалыматтар нормалдуулук тестинен өтпөй калганда, Манн-Уитни тести жүргүзүлгөн. Жашоо маалыматтары Мантел-Кокс тестин колдонуу менен талданган. РНК-сек ген деңгээлиндеги дифференциалдык экспрессияны талдоо үчүн DESeq2 пакети (1.28.1 версиясы) колдонулган. Графиктеги горизонталдык тилке медиананы билдирет. Бардык тесттер үчүн босого катары P = 0,05 маанилик мааниси колдонулган.
Изилдөөнүн дизайны боюнча көбүрөөк маалымат алуу үчүн, ушул макалага шилтеме берилген Nature Research Report рефератын караңыз.
MS протеомикалык маалыматтары PRIDE өнөктөштөрүнүн репозиторийи (https://www.ebi.ac.uk/pride/) аркылуу PXD032157 маалымат топтомунун идентификатору менен ProteomeXchange консорциумуна (http://proteomecentral.proteomexchange.org) сакталган.
РНК-seq маалыматтар топтому Ген экспрессиясынын комплекстүү китепканасында (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) GSE198665 сериялык жазуусу астында сакталат.
Учурдагы изилдөө учурунда түзүлгөн жана/же талданган кошумча маалыматтар топтомдорун тиешелүү авторлордон акылга сыярлык суроо-талап боюнча алууга болот. Бул макалада баштапкы маалыматтар келтирилген.
Де Луф, А. Экдистероиддер: Курт-кумурскалардын жыныстык стероиддерине көңүл бурулбайбы? Эркек: Кара куту. Курт-кумурскалар жөнүндө илим. 13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гидроксиэкдизон жана Anopheles stephensтеги энелик бездин өнүгүшү. Курт-кумурскалардын физиологиясы журналы. 28, 97–109 (1982).