Пропион кислотасы (PPA), грибокко каршы каражат жана кеңири таралган тамак-аш кошулмасы, чычкандарда ашказан-ичеги дисфункциясы менен коштолгон нейроөнүгүүнүн анормалдуулугун пайда кылары көрсөтүлдү, бул ичеги дисбактериозунан улам келип чыгышы мүмкүн. Тамак-аштагы PPA таасири менен ичеги микробиотасы дисбактериозунун ортосундагы байланыш сунушталган, бирок түздөн-түз изилдене элек. Бул жерде биз дисбактериозго алып келиши мүмкүн болгон ичеги микробиотасы курамындагы PPA менен байланышкан өзгөрүүлөрдү изилдедик. Дарыланбаган диета (n=9) жана PPA менен байытылган диета (n=13) менен азыктанган чычкандардын ичеги микробиомдору микробдук курамындагы жана бактериялык метаболизм жолдорундагы айырмачылыктарды баалоо үчүн узак аралыкка метагеномикалык секвенирлөөнү колдонуу менен секвенирленген. Тамак-аштагы PPA бир нече Bacteroides, Prevotella жана Ruminococcus түрлөрүн камтыган маанилүү таксондордун санынын көбөйүшү менен байланыштуу болгон, алардын мүчөлөрү мурда PPA өндүрүшүнө катышкан. PPA таасир эткен чычкандардын микробиомдорунда липиддик метаболизм жана стероиддик гормондордун биосинтези менен байланышкан көбүрөөк жолдор болгон. Биздин жыйынтыктар PPA ичеги микробиотасын жана ага байланыштуу метаболизм жолдорун өзгөртө аларын көрсөтүп турат. Бул байкалган өзгөрүүлөр керектөө үчүн коопсуз деп классификацияланган консерванттар ичеги микробиотанын курамына жана өз кезегинде адамдын ден соолугуна таасир этиши мүмкүн экенин баса белгилейт.
Адамдын микробиомасы көбүнчө "дененин акыркы органы" деп аталат жана адамдын ден соолугунда маанилүү ролду ойнойт (Baquero жана Nombela, 2012). Атап айтканда, ичеги микробиомасы системалык таасири жана көптөгөн маанилүү функциялардагы ролу менен белгилүү. Комменсалдык бактериялар ичегиде көп кездешет, алар бир нече экологиялык нишаларды ээлейт, азык заттарды колдонот жана потенциалдуу патогендер менен атаандашат (Jandhyala et al., 2015). Ичеги микробиотасынын ар кандай бактериялык компоненттери витаминдер сыяктуу маанилүү азык заттарды өндүрүп, тамак сиңирүүнү жакшырта алат (Rowland et al., 2018). Бактериялык метаболиттер ткандардын өнүгүшүнө таасир этип, зат алмашуу жана иммундук жолдорду жакшыртаары да көрсөтүлгөн (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Адамдын ичеги микробиомунун курамы өтө ар түрдүү жана тамактануу, жыныс, дары-дармектер жана ден соолук абалы сыяктуу генетикалык жана экологиялык факторлорго көз каранды (Kumbhare et al., 2019).
Эненин тамактануусу түйүлдүктүн жана жаңы төрөлгөн баланын өнүгүүсүнүн маанилүү компоненти жана өнүгүүгө таасир этиши мүмкүн болгон кошулмалардын болжолдуу булагы болуп саналат (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Мындай кызыктуу кошулмалардын бири - пропион кислотасы (PPA), бактериялык ачытуудан алынган кыска чынжырлуу май кислотасынын кошумча продуктусу жана тамак-аш кошулмасы (den Besten et al., 2013). PPA антибактериалдык жана грибокко каршы касиетке ээ жана ошондуктан тамак-аш консерванты катары жана өнөр жайлык колдонмолордо көктүн жана бактериялардын өсүшүн токтотуу үчүн колдонулат (Wemmenhove et al., 2016). PPA ар кандай ткандарда ар кандай таасирге ээ. Боордо PPA макрофагдардагы цитокиндердин экспрессиясына таасир этүү менен сезгенүүгө каршы таасирге ээ (Kawasoe et al., 2022). Бул жөнгө салуучу таасир башка иммундук клеткаларда да байкалып, сезгенүүнүн төмөндөшүнө алып келген (Haase et al., 2021). Бирок, мээде тескери таасир байкалган. Мурунку изилдөөлөр PPA таасири чычкандарда аутизмге окшош жүрүм-турумду пайда кыларын көрсөткөн (El-Ansary et al., 2012). Башка изилдөөлөр PPA глиозду пайда кылып, мээдеги сезгенүүнү пайда кылуучу жолдорду активдештире аларын көрсөттү (Abdelli et al., 2019). PPA алсыз кислота болгондуктан, ал ичеги эпителийи аркылуу канга жайылып, ошону менен кан-мээ тосмосун, ошондой эле плацентаны камтыган чектөөчү тоскоолдуктардан өтө алат (Stinson et al., 2019), бул PPAнын бактериялар тарабынан өндүрүлгөн жөнгө салуучу метаболит катары маанисин баса белгилейт. Аутизм үчүн коркунуч фактору катары PPAнын потенциалдуу ролу учурда изилденип жатканы менен, анын аутизм менен ооруган адамдарга тийгизген таасири нейрондук дифференциацияны пайда кылуудан тышкары дагы көп болушу мүмкүн.
Ич өткөк жана ич катуу сыяктуу ашказан-ичеги симптомдору нейроөнүгүү бузулуулары бар бейтаптарда көп кездешет (Cao et al., 2021). Мурунку изилдөөлөр аутизм спектринин бузулуулары (ASD) бар бейтаптардын микробиомасы дени сак адамдардыкынан айырмаланарын көрсөтүп, ичеги микробиотасында дисбиоз бар экенин көрсөтүп турат (Finegold et al., 2010). Ошо сыяктуу эле, сезгенүү ичеги оорулары, семирүү, Альцгеймер оорусу ж.б. бар бейтаптардын микробиомунун мүнөздөмөлөрү да дени сак адамдардыкынан айырмаланат (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Бирок, бүгүнкү күнгө чейин ичеги микробиомасы менен неврологиялык оорулар же симптомдордун ортосунда себептик байланыш аныкталган эмес (Yap et al., 2021), бирок бул оорулардын айрымдарында бир нече бактерия түрлөрү роль ойнойт деп эсептелет. Мисалы, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio жана башка уруулар аутизм менен ооругандардын микробиотасында көбүрөөк кездешет (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Белгилей кетчү нерсе, бул уруулардын айрымдарынын мүчө түрлөрү PPA өндүрүү менен байланышкан гендерге ээ экени белгилүү (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). PPAнын микробго каршы касиеттерин эске алганда, анын көптүгүн көбөйтүү PPA өндүрүүчү бактериялардын өсүшү үчүн пайдалуу болушу мүмкүн (Jacobson et al., 2018). Ошентип, PFAга бай чөйрө ичеги микробиотасында, анын ичинде ашказан-ичеги патогендеринде өзгөрүүлөргө алып келиши мүмкүн, бул ашказан-ичеги симптомдоруна алып келүүчү потенциалдуу факторлор болушу мүмкүн.
Микробиомду изилдөөдөгү негизги суроо - микробдук курамдагы айырмачылыктар негизги оорулардын себебиби же симптомубу. Тамактануу, ичеги микробиомасы жана неврологиялык оорулардын ортосундагы татаал байланышты аныктоонун биринчи кадамы - диетанын микробдук курамга тийгизген таасирин баалоо. Ушул максатта биз PPAга бай же PPA жетишсиз диета менен азыктанган чычкандардын тукумдарынын ичеги микробиомдорун салыштыруу үчүн узак окулган метагеномикалык ырааттуулукту колдондук. Тукумдар энелери менен бирдей диета менен азыктанышкан. Биз PPAга бай диета ичеги микробдук курамынын жана микробдук функционалдык жолдордун, айрыкча PPA метаболизми жана/же PPA өндүрүшү менен байланышкан жолдордун өзгөрүшүнө алып келет деп божомолдогонбуз.
Бул изилдөөдө Борбордук Флорида Университетинин Жаныбарларды Багуу жана Колдонуу Институтунун Комитетинин (UCF-IACUC) көрсөтмөлөрүнө ылайык (Жаныбарларды Колдонууга Уруксаттын Номери: PROTO202000002) глияга мүнөздүү GFAP промоутеринин көзөмөлүндө жашыл флуоресценттик белокту (GFP) ашыкча экспрессиялаган FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J трансгендик чычкандары (Jackson Laboratories) колдонулган. Эмчектен ажыратылгандан кийин, чычкандар ар бир жыныстагы 1–5 чычкандан турган капастарга өзүнчө жайгаштырылган. Чычкандар тазаланган контролдук диета (өзгөртүлгөн ачык этикеткалуу стандарттык диета, 16 ккал% май) же натрий пропионаты кошулган диета (өзгөртүлгөн ачык этикеткалуу стандарттык диета, 16 ккал% май, 5000 ppm натрий пропионатын камтыган) менен эркин түрдө азыктандырылган. Колдонулган натрий пропионатынын көлөмү жалпы тамак-аш салмагына 5000 мг PFA/кг барабар болгон. Бул тамак-аш консерванты катары колдонууга бекитилген PPAнын эң жогорку концентрациясы. Бул изилдөөгө даярдануу үчүн, ата-эне чычкандар жупташуудан 4 жума мурун эки диета менен тең азыктанышкан жана эненин кош бойлуулугу учурунда да улантылган. Тукум чычкандар [22 чычкан, 9 контролдук топ (6 эркек, 3 ургаачы) жана 13 PPA (4 эркек, 9 ургаачы)] эмчектен ажыратылып, андан кийин эненин диетасын 5 ай бою улантышкан. Тукум чычкандар 5 айлык курагында союлган жана алардын ичегилериндеги заң чогултулуп, алгач 1,5 мл микроцентрифуга түтүктөрүндө -20°C температурада сакталган, андан кийин кожоюндун ДНКсы түгөнгөнгө жана микробдук нуклеин кислоталары алынганга чейин -80°C тоңдургучка которулган.
Кожоюндун ДНКсы өзгөртүлгөн протоколго ылайык алынып салынган (Charalampous et al., 2019). Кыскача айтканда, заңдын курамы 500 мкл InhibitEXке (Qiagen, Cat#/ID: 19593) которулуп, тоңдурулган абалда сакталган. Бир экстракцияда эң көп дегенде 1-2 заң гранулдарын иштетүү керек. Андан кийин заңдын курамы түтүктүн ичиндеги пластикалык пестлди колдонуп механикалык түрдө гомогендештирилип, суспензия пайда болгон. Үлгүлөрдү 10 000 RCFде 5 мүнөт же үлгүлөр гранулдашканга чейин центрифугалаңыз, андан кийин үстүнкү катмарды сордуруп алып, гранулду 250 мкл 1× PBSте кайра эритиңиз. Эукариоттук клетка мембраналарын жумшартуу үчүн жуугуч каражат катары үлгүгө 250 мкл 4,4% сапонин эритмесин (TCI, продукт номери S0019) кошуңуз. Үлгүлөр жылмакай болгонго чейин акырын аралаштырылып, бөлмө температурасында 10 мүнөт инкубацияланган. Андан кийин, эукариоттук клеткаларды бузуу үчүн, үлгүгө 350 мкл нуклеазасыз суу кошулуп, 30 секунд инкубацияланып, андан кийин 12 мкл 5 М NaCl кошулган. Андан кийин үлгүлөр 6000 RCFде 5 мүнөт центрифугаланган. Супернатант соруп алынып, гранулду 100 мкл 1X PBSте кайра эритиңиз. Кожоюндун ДНКсын алып салуу үчүн, 100 мкл HL-SAN буферин (12,8568 г NaCl, 4 мл 1М MgCl2, 36 мл нуклеазасыз суу) жана 10 мкл HL-SAN ферментин (ArticZymes P/N 70910-202) кошуңуз. Үлгүлөр пипеткалоо жолу менен жакшылап аралаштырылып, Eppendorf™ ThermoMixer C аппаратында 37°C температурада 30 мүнөт 800 айн/мин ылдамдыкта инкубацияланган. Инкубациядан кийин, 6000 RCFде 3 мүнөт центрифугаланып, эки жолу 800 мкл жана 1000 мкл 1X PBS менен жуулган. Акырында, гранулду 100 мкл 1X PBSте кайра эритилген.
Жалпы бактериялык ДНК New England Biolabs Monarch геномдук ДНК тазалоо комплекти (New England Biolabs, Ипсвич, MA, Cat# T3010L) аркылуу бөлүнүп алынган. Комплект менен берилген стандарттык иштөө процедурасы бир аз өзгөртүлгөн. Акыркы элюция үчүн операциядан мурун нуклеазасыз сууну 60°C температурада инкубациялап, сактаңыз. Ар бир үлгүгө 10 мкл протеиназа К жана 3 мкл RNase A кошуңуз. Андан кийин 100 мкл клетка лизис буферин кошуп, акырын аралаштырыңыз. Андан кийин үлгүлөр Eppendorf™ ThermoMixer Cде 56°C жана 1400 айн/мин температурада кеминде 1 саат жана 3 саатка чейин инкубацияланган. Инкубацияланган үлгүлөр 12 000 RCFде 3 мүнөт центрифугаланган жана ар бир үлгүдөн алынган үстүнкү катмар 400 мкл байланыштыруучу эритмеси бар өзүнчө 1,5 мл микроцентрифуга түтүгүнө которулган. Андан кийин түтүктөр 1 секунддук аралык менен 5–10 секунд импульстук вортекстелген. Ар бир үлгүнүн суюктугунун толук курамын (болжол менен 600–700 мкл) агымдуу чогултуу түтүгүнө жайгаштырылган чыпка картриджине куюңуз. Түтүкчөлөр ДНКнын баштапкы байланышын камсыз кылуу үчүн 1000 RCFде 3 мүнөт центрифугаланган, андан кийин калган суюктукту алып салуу үчүн 12000 RCFде 1 мүнөт центрифугаланган. Үлгү тилкеси жаңы чогултуу түтүгүнө которулуп, андан кийин эки жолу жуулган. Биринчи жуу үчүн ар бир түтүккө 500 мкл жуу буферин кошуңуз. Түтүктү 3–5 жолу оодарып, андан кийин 12000 RCFде 1 мүнөт центрифугалаңыз. Чогултуу түтүгүндөгү суюктукту төгүп, чыпка картриджин ошол эле чогултуу түтүгүнө кайра салыңыз. Экинчи жуу үчүн, чыпкага 500 мкл жуу буферин оодарбастан кошуңуз. Үлгүлөр 12000 RCFде 1 мүнөт центрифугаланган. Чыпканы 1,5 мл LoBind® түтүгүнө салып, 100 мкл алдын ала жылытылган нуклеазасыз суу кошуңуз. Чыпкалар бөлмө температурасында 1 мүнөт инкубацияланып, андан кийин 12 000 RCFде 1 мүнөт центрифугаланган. Элюцияланган ДНК -80°C температурада сакталган.
ДНКнын концентрациясы Qubit™ 4.0 флуорометри менен сандык жактан аныкталган. ДНК өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык Qubit™ 1X dsDNA жогорку сезгичтик комплекти (категория № Q33231) менен даярдалган. ДНК фрагментинин узундугунун бөлүштүрүлүшү Aglient™ 4150 же 4200 TapeStation менен өлчөнгөн. ДНК Agilent™ геномдук ДНК реагенттери (категория № 5067-5366) жана геномдук ДНК экран тасмасы (категория № 5067-5365) менен даярдалган. Китепкананы даярдоо өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR штрих-коддоо комплекти (SQK-RPB004) менен жүргүзүлгөн. ДНК Min106D агым клеткасы (R 9.4.1) менен ONT GridION™ Mk1 секвенсери менен секвенирленген. Ырааттуулук жөндөөлөрү: жогорку тактыктагы базалык чакыруу, минималдуу q мааниси 9, штрих-кодду орнотуу жана штрих-кодду кыркуу болгон. Үлгүлөр 72 саат бою ырааттуулукта текшерилген, андан кийин базалык чалуу маалыматтары андан ары иштетүү жана талдоо үчүн берилген.
Биоинформатиканы иштетүү мурда сүрөттөлгөн ыкмаларды колдонуу менен жүргүзүлдү (Greenman et al., 2024). Ырааттуулукту аныктоодон алынган FASTQ файлдары ар бир үлгү үчүн каталогдорго бөлүнгөн. Биоинформатиканы талдоодон мурун, маалыматтар төмөнкү түтүк аркылуу иштетилген: алгач, үлгүлөрдүн FASTQ файлдары бир FASTQ файлына бириктирилген. Андан кийин, 1000 bpден кыска окуулар Filtlong v. 0.2.1 аркылуу чыпкаланган, өзгөртүлгөн жалгыз параметр –min_length 1000 болгон (Wick, 2024). Андан ары чыпкалоодон мурун, окуу сапаты NanoPlot v. 1.41.3 аркылуу төмөнкү параметрлер менен көзөмөлдөнгөн: –fastq –plots dot –N50 -o(Де Костер жана Радемейкерс, 2023). Окуулар төмөнкү параметрлер менен хост тарабынан булганган окууларды алып салуу үчүн minimap2 v. 2.24-r1122 колдонуп, чычкандын шилтеме геному GRCm39 (GCF_000001635.27) менен тегизделген: -L -ax map-ont(Ли, 2018). Түзүлгөн тегиздөө файлдары samtools v. 1.16.1 версиясында samtools view -b (Danecek et al., 2021) аркылуу BAM форматына айландырылган. Андан кийин тегизделбеген окуулар samtools view -b -f 4 аркылуу аныкталган, бул окуулар хост геномуна таандык эмес экенин көрсөткөн. Тегизделбеген окуулар демейки параметрлери бар samtools bam2fq аркылуу FASTQ форматына кайра айландырылган. NanoPlot мурда сүрөттөлгөн жөндөөлөрдү колдонуп, андан ары чыпкаланган окууларда кайра иштетилген. Чыпкалоодон кийин, метагеномикалык маалыматтар metaflye v. 2.8.2-b1689 аркылуу төмөнкү параметрлер менен чогултулган: –nano-raw–meta (Колмогоров ж.б., 2020). Калган параметрлерди демейки маанилеринде калтырыңыз. Чогултуудан кийин, чыпкаланган окуулар minimap2 аркылуу чогулушка туташтырылган жана -ax map-ont параметри SAM форматында тегиздөө файлын түзүү үчүн колдонулган. Чогултуу алгач racon v. 1.4.20 аркылуу төмөнкү параметрлер менен такталды: -m 8 -x -6 -g -8 -w 500 -u (Vaser ж.б., 2017). racon бүткөндөн кийин, ал medaka v. 1.7.2 менен medaka_consesus аркылуу андан ары такталды, -m параметринен башка бардык параметрлер демейки маанилеринде калтырылды. -m параметри биздин маалыматтар үчүн колдонулган агым клеткасынын химиясын жана жогорку тактыктагы базалык чакырууларды көрсөтүү үчүн r941_min_hac_g507 деп коюлган (nanoporetech/medaka, 2024). Чыпкаланган маалыматтар (мындан ары микробдук маалыматтар деп аталат) жана акыркы тазаланган жыйынды кийинки талдоо үчүн колдонулган.
Таксономик классификациялоо үчүн, окулган жана чогултулган контигдер Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019) колдонуу менен классификацияланган. Окуу жана чогултуу үчүн тиешелүү түрдө отчетторду жана чыгаруу файлдарын түзүңүз. Окуу жана чогултууларды талдоо үчүн –use-names опциясын колдонуңуз. Окуу сегменттери үчүн –gzip-кысылган жана –жупташтырылган опциялар көрсөтүлгөн. Метагеномдордогу таксондордун салыштырмалуу көптүгү Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017) колдонуу менен бааланган. Алгач биз төмөнкү параметрлер менен bracken-build колдонуп, 1000 базаны камтыган kmer маалымат базасын түздүк: -d-k 35 -l 1000 Курулгандан кийин, bracken kraken2 тарабынан түзүлгөн отчеттун негизинде иштейт жана маалыматтарды төмөнкү параметрлерди колдонуп чыпкалайт: -d -I -O-p 1000 -l

Алардын ичинен талданып жаткан классификация деңгээлине жараша P, G же S тандалат. Жалган оң классификациялардын таасирин минималдаштыруу үчүн, 1e-4 (1/10,000 окуу) минималдуу салыштырмалуу молчулук босогосу кабыл алынган. Статистикалык анализге чейин, Bracken тарабынан билдирилген салыштырмалуу молчулуктар (fraction_total_reads) борборлоштурулган логарифмдик катышты (CLR) өзгөртүү аркылуу трансформацияланган (Aitchison, 1982). CLR ыкмасы маалыматтарды трансформациялоо үчүн тандалып алынган, анткени ал масштаб боюнча өзгөрүлбөйт жана сейрек эмес маалыматтар топтомдору үчүн жетиштүү (Gloor et al., 2017). CLR өзгөртүүсүндө табигый логарифм колдонулат. Bracken тарабынан билдирилген саноо маалыматтары салыштырмалуу логарифмдик туюнтманы (RLE) колдонуу менен нормалдаштырылган (Anders and Huber, 2010). Сандар matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 жана ырааттуу логарифмдердин айкалышын колдонуу менен түзүлгөн (Gloor et al., 2017). 0.12.2 жана стантанотациялар v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Bacillus/Bacteroidetes катышы ар бир үлгү үчүн нормалдаштырылган бактериялардын санын колдонуу менен эсептелген. Таблицаларда келтирилген маанилер 4 ондук белгиге чейин тегеректелген. Simpson ар түрдүүлүк индекси KrakenTools v. 1.2 пакетинде берилген alpha_diversity.py скриптин колдонуу менен эсептелген (Lu et al., 2022). Bracken отчету скриптте берилген жана -an параметри үчүн Simpson индексинин "Si" берилген. Көптүктөгү олуттуу айырмачылыктар орточо CLR айырмачылыктары ≥ 1 же ≤ -1 катары аныкталган. Орточо CLR айырмасы ±1 болсо, үлгү түрүнүн көптүгүнүн 2,7 эсеге көбөйгөнүн көрсөтөт. (+/-) белгиси таксон PPA үлгүсүндө жана контролдук үлгүдө тиешелүүлүгүнө жараша көбүрөөк экендигин көрсөтөт. Маанилүүлүк Манн-Уитни U тести (Виртэнен жана башкалар, 2020) аркылуу аныкталган. Statsmodels v. 0.14 (Бенжамини жана Хохберг, 1995; Сиболд жана Перктольд, 2010) колдонулган жана бир нече жолу текшерүүнү оңдоо үчүн Бенжамини-Хохберг процедурасы колдонулган. Статистикалык маанилүүлүктү аныктоо үчүн босого катары ≤ 0.05 түзөтүлгөн p-мааниси колдонулган.
Гендерди аннотациялоо жана салыштырмалуу молчулукту баалоо Маранга жана башкалар тарабынан сүрөттөлгөн протоколдун өзгөртүлгөн версиясын колдонуу менен жүргүзүлдү (Маранга жана башкалар, 2023). Алгач, SeqKit v. 2.5.1 (Шен жана башкалар, 2016) колдонуп, бардык жыйындардан 500 б.п.ден кыска контигдер алынып салынды. Андан кийин тандалган жыйындар пан-метагеномго бириктирилди. Ачык окуу алкактары (ORF) Prodigal v. 1.0.1 (Prodigal v. 2.6.3 параллелдүү версиясы) аркылуу төмөнкү параметрлер менен аныкталды: -d-f gff-i -O-T 24 -p meta -C 10000 (Hyett et al., 2012; Jaenicke, 2024). Андан кийин пайда болгон нуклеотиддик файлдар бардык толук эмес гендерди алып салуу үчүн Python аркылуу чыпкаланган. Андан кийин CD-HIT v. 4.8.1 гендерди төмөнкү параметрлер менен кластерлөө үчүн колдонулган: cd-hit-est -i -O-c 0.95 -s 0.85 -aS 0.9 -n 10 -d 256 -M 350000 -T 24 -l 100 -g 1 (Fu et al., 2012). Түзүлгөн ашыкча эмес ген каталогу гендердин көптүгүн жана аннотациясын баалоо үчүн колдонулган. Салыштырмалуу гендердин көптүгү KMA v. 1.4.9 (Clausen et al., 2018) колдонуу менен бааланган. Алгач, төмөнкү параметрлер менен KMA индексин колдонуп индекс файлын түзүңүз: -i -OАндан кийин, Биоинформатика түтүгү бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй, ар бир үлгү үчүн микробдук окуулар менен бирге түзүлгөн индексти колдонуп, KMA төмөнкү параметрлер менен иштетилди: -i -O-t_db-bcNano -bc 0.7 -ef -t 24. Андан кийин, гендердин саны CLR аркылуу нормалдаштырылган жана Sci-kit learnдин негизги компоненттик анализ (PCA) классы колдонулган (Pedregosa et al., 2011). Болжолдонгон гендин аннотациясы eggNOG v. 2.1.12 жана eggNOG маалымат базасынын 5.0.2 версиясынын emapper.py скриптин колдонуп, төмөнкү параметрлер менен ашыкча эмес ген каталогунда аткарылган: –itype CDS –cpu 24 -i– Маалыматтар каталогу–go_evidence Электрондук эмес – чыгаруу– Чыгаруу каталогу–target_orthologs баары –seed_ortholog_evalue 0.001 –seed_ortholog_score 60 –query_cover 20 –subject_cover 0 –translate –override –temp_dir(Cantalapiedra et al., 2021). KMA жыйынтыктары жетиштүү шаблонду камтуу жана шаблондун окшоштугу (≥ 90%) жана көптүгү (тереңдиги ≥ 3) бар гендерди тандоо үчүн текшерилген. KMA тереңдигинин жыйынтыктары жогоруда сүрөттөлгөндөй CLR колдонуу менен өзгөртүлгөн. Андан кийин KMA жыйынтыктары ар бир ген үчүн контиг булагын колдонуу менен функционалдык аннотация жана классификация жыйынтыктарынан алынган контиг IDлери менен салыштырылган. Таксонадагыдай эле, гендин көптүгүндөгү олуттуу айырмачылыктар CLRдин орточо айырмасы ≥ 1 же ≤ -1 болгон гендер катары аныкталган, бул гендин тиешелүүлүгүнө жараша PPA же контролдук үлгүлөрдө көбүрөөк экенин көрсөткөн белги (+/-) менен.
Гендер алгач Киото гендер жана геномдор энциклопедиясынын (KEGG) ортологдук (KO) идентификаторлоруна ылайык топтолгон, алар eggNOG тарабынан ген жолдорунун көптүгүн салыштыруу үчүн дайындалган. Талдоодон мурун нокаутсуз же бир нече нокаутсуз гендер алынып салынган. Андан кийин ар бир үлгүдөгү KOнун орточо көптүгү эсептелип, статистикалык анализ жүргүзүлгөн. PPA метаболизм гендери KEGG_Pathway тилкесинде ko00640 сабы берилген ар кандай ген катары аныкталган, бул KEGGге ылайык пропионат метаболизминдеги ролду көрсөтөт. PPA өндүрүшү менен байланышкан деп аныкталган гендер 1-кошумча таблицада келтирилген (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Ар бир үлгү түрүндө бир топ көп болгон PPA метаболизми жана өндүрүш гендерин аныктоо үчүн пермутация тесттери жүргүзүлдү. Талданган ар бир ген үчүн миң пермутация жүргүзүлдү. Статистикалык маанилүүлүктү аныктоо үчүн чек катары 0,05 p-мааниси колдонулган. Кластердеги репрезентативдик гендердин аннотацияларынын негизинде кластердин ичиндеги жеке гендерге функционалдык аннотациялар дайындалган. PPA метаболизми жана/же PPA өндүрүшү менен байланышкан таксондорду Kraken2 чыгаруу файлдарындагы контиг идентификаторлорун eggNOG колдонуу менен функционалдык аннотация учурунда сакталган ошол эле контиг идентификаторлору менен дал келтирүү аркылуу аныктоого болот. Маанилүүлүктү текшерүү мурда сүрөттөлгөн Манн-Уитни U тести аркылуу жүргүзүлдү. Көп жолу текшерүү үчүн коррекция Бенджамини-Хохберг процедурасы аркылуу жүргүзүлдү. Статистикалык маанилүүлүктү аныктоо үчүн чектик чек катары ≤ 0,05 p-мааниси колдонулган.
Чычкандардын ичеги микробиомасынын ар түрдүүлүгү Симпсондун ар түрдүүлүк индексин колдонуу менен бааланган. Контролдук жана PPA үлгүлөрүнүн ортосунда уруу жана түр ар түрдүүлүгү жагынан эч кандай олуттуу айырмачылыктар байкалган эмес (урук үчүн p-мааниси: 0,18, түр үчүн p-мааниси: 0,16) (1-сүрөт). Андан кийин микробдук курам негизги компоненттик анализ (PCA) аркылуу салыштырылган. 2-сүрөттө үлгүлөрдүн филасы боюнча кластерлениши көрсөтүлгөн, бул PPA жана контролдук үлгүлөрдүн ортосунда микробиомалардын түрдүк курамында айырмачылыктар бар экенин көрсөтүп турат. Бул кластерленүү уруу деңгээлинде анчалык байкалган эмес, бул PPA айрым бактерияларга таасир этерин көрсөтүп турат (1-кошумча сүрөт).
1-сүрөт. Чычкандын ичеги микробиомунун тукумдарынын альфа түрдүүлүгү жана түр курамы. PPA жана контролдук үлгүлөрдөгү (A) жана (B) тукумдарынын Симпсон түрдүүлүгүнүн индекстерин көрсөткөн кутуча графиктери. Маанилүүлүгү Манн-Уитни U тести аркылуу аныкталган жана Бенджамини-Хохберг процедурасы аркылуу көп тараптуу коррекция жүргүзүлгөн. ns, p-мааниси маанилүү болгон эмес (p>0,05).
2-сүрөт. Түр деңгээлиндеги чычкандын ичеги микробиомунун курамынын негизги компоненттерди талдоонун жыйынтыктары. Негизги компоненттерди талдоо графиги үлгүлөрдүн алардын алгачкы эки негизги компоненти боюнча бөлүштүрүлүшүн көрсөтөт. Түстөр үлгүнүн түрүн көрсөтөт: PPA таасир эткен чычкандар кызгылт көк, ал эми контролдук чычкандар сары. Негизги компоненттер 1 жана 2 тиешелүүлүгүнө жараша x жана y огуна түшүрүлгөн жана алардын түшүндүрүлгөн дисперсия катышы катары көрсөтүлөт.
RLE трансформацияланган саноо маалыматтарын колдонуу менен, контролдук жана PPA чычкандарында бактериялардын/бациллалардын медианалык катышынын олуттуу төмөндөшү байкалган (контролдук: 9.66, PPA: 3.02; p-мааниси = 0.0011). Бул айырмачылык контролдук топко салыштырмалуу PPA чычкандарында бактериялардын көптүгүнөн улам болгон, бирок айырмачылык анчалык деле маанилүү болгон эмес (контролдук орточо CLR: 5.51, PPA орточо CLR: 6.62; p-мааниси = 0.054), ал эми бактериялардын көптүгү окшош болгон (контролдук орточо CLR: 7.76, PPA орточо CLR: 7.60; p-мааниси = 0.18).
Ичеги микробиомунун таксономиялык мүчөлөрүнүн көптүгүн талдоо 1 филум жана 77 түр PPA жана контролдук үлгүлөрдүн ортосунда олуттуу айырмаланарын көрсөттү (2-кошумча таблица). PPA үлгүлөрүндө 59 түрдүн көптүгү контролдук үлгүлөргө караганда бир топ жогору болгон, ал эми контролдук үлгүлөрдө 16 гана түрдүн көптүгү PPA үлгүлөрүнө караганда жогору болгон (3-сүрөт).
3-сүрөт. PPA жана контролдук чычкандардын ичеги микробиомундагы таксондордун дифференциалдык көптүгү. Жанар тоолордун графиктери PPA жана контролдук үлгүлөрдүн ортосундагы уруулардын (A) же түрлөрдүн (B) көптүгүндөгү айырмачылыктарды көрсөтөт. Боз чекиттер таксондордун көптүгүндө олуттуу айырмачылык жок экенин көрсөтөт. Түстүү чекиттер көптүктүн олуттуу айырмачылыктарын көрсөтөт (p-мааниси ≤ 0,05). Үлгү түрлөрүнүн ортосундагы көптүктүн эң чоң айырмачылыктары бар алдыңкы 20 таксон тиешелүүлүгүнө жараша кызыл жана ачык көк түстөр менен көрсөтүлгөн (контролдук жана PPA үлгүлөрү). Сары жана кочкул кызыл чекиттер контролдук же PPA үлгүлөрүндө контролдукка караганда кеминде 2,7 эсе көп болгон. Кара чекиттер орточо CLR айырмачылыктары -1 жана 1 ортосунда болгон бир топ айырмаланган көптүккө ээ таксондорду билдирет. P маанилери Манн-Уитни U тести менен эсептелген жана Бенджамини-Хохберг процедурасын колдонуу менен көп жолу текшерүү үчүн оңдолгон. Калың орточо CLR айырмачылыктары көптүктүн олуттуу айырмачылыктарын көрсөтөт.
Ичеги микробдук курамын талдап чыккандан кийин, биз микробиомдун функционалдык аннотациясын жүргүздүк. Төмөнкү сапаттагы гендерди чыпкалагандан кийин, бардык үлгүлөрдө жалпысынан 378 355 уникалдуу ген аныкталды. Бул гендердин трансформацияланган саны негизги компоненттерди талдоо (PCA) үчүн колдонулган жана натыйжалар алардын функционалдык профилдерине негизделген үлгү түрлөрүнүн кластерлешүүсүнүн жогорку деңгээлин көрсөттү (4-сүрөт).
4-сүрөт. Чычкандын ичеги микробиомасынын функционалдык профилин колдонуу менен PCA жыйынтыктары. PCA графиги үлгүлөрдүн алардын алгачкы эки негизги компоненти боюнча бөлүштүрүлүшүн көрсөтөт. Түстөр үлгүнүн түрүн көрсөтөт: PPAга дуушар болгон чычкандар кызгылт көк, ал эми контролдук чычкандар сары. 1 жана 2 негизги компоненттер тиешелүүлүгүнө жараша x жана y огуна жайгаштырылган жана алардын түшүндүрүлгөн дисперсия катышы катары көрсөтүлөт.
Андан кийин биз ар кандай үлгү түрлөрүндөгү KEGG нокауттарынын көптүгүн изилдедик. Жалпысынан 3648 уникалдуу нокаут аныкталды, алардын ичинен 196сы контролдук үлгүлөрдө бир кыйла көп, ал эми 106сы PPA үлгүлөрүндө көбүрөөк болгон (5-сүрөт). Контролдук үлгүлөрдө жалпысынан 145 ген жана PPA үлгүлөрүндө 61 ген аныкталган, алардын көптүгү бир кыйла айырмаланган. Липиддик жана аминокислота алмашуусуна байланыштуу жолдор PPA үлгүлөрүндө бир кыйла байытылган (3-кошумча таблица). Азот алмашуусуна жана күкүрт реле системаларына байланыштуу жолдор контролдук үлгүлөрдө бир кыйла байытылган (3-кошумча таблица). Аминокыч/нуклеотиддик алмашууга (ko:K21279) жана инозитолфосфат алмашуусуна (ko:K07291) байланыштуу гендердин көптүгү PPA үлгүлөрүндө бир кыйла жогору болгон (5-сүрөт). Контролдук үлгүлөрдө бензоат алмашуусуна (ko:K22270), азот алмашуусуна (ko:K00368) жана гликолиз/глюконеогенезге (ko:K00131) байланыштуу гендер бир кыйла көп болгон (5-сүрөт).
Сүрөт 5. PPA жана контролдук чычкандардын ичеги микробиомундагы KOлордун дифференциалдык көптүгү. Вулкандык график функционалдык топтордун (KO) көптүгүндөгү айырмачылыктарды көрсөтөт. Боз чекиттер үлгү түрлөрүнүн ортосунда көптүгү анчалык деле айырмаланбаган KOлорду көрсөтөт (p-мааниси > 0,05). Түстүү чекиттер көптүктүн олуттуу айырмачылыктарын көрсөтөт (p-мааниси ≤ 0,05). Үлгү түрлөрүнүн ортосундагы көптүктүн эң чоң айырмачылыктары бар 20 KO тиешелүүлүгүнө жараша кызыл жана ачык көк түстөр менен көрсөтүлгөн, бул тиешелүүлүгүнө жараша контролдук жана PPA үлгүлөрүнө туура келет. Сары жана кочкул кызыл чекиттер тиешелүүлүгүнө жараша контролдук жана PPA үлгүлөрүндө кеминде 2,7 эсе көп болгон KOлорду көрсөтөт. Кара чекиттер орточо CLR айырмачылыктары -1 жана 1 ортосунда болгон, бир кыйла айырмаланган KOлорду көрсөтөт. P маанилери Манн-Уитни U тести аркылуу эсептелген жана Бенджамини-Хохберг процедурасын колдонуу менен бир нече салыштыруулар үчүн туураланган. NaN KO KEGGдеги жолго кирбей турганын көрсөтөт. Калың орточо CLR айырмачылык маанилери көптүктүн олуттуу айырмачылыктарын көрсөтөт. Көрсөтүлгөн КОлор кайсы жолдорго таандык экени тууралуу кеңири маалымат алуу үчүн 3-кошумча таблицаны караңыз.
Аннотацияланган гендердин арасында 1601 ген үлгү түрлөрүнүн ортосунда бир топ айырмаланган (p ≤ 0,05), ар бир ген кеминде 2,7 эсе көп болгон. Бул гендердин ичинен 4 ген контролдук үлгүлөрдө, ал эми 1597 ген PPA үлгүлөрүндө көп болгон. PPA антимикробдук касиетке ээ болгондуктан, биз үлгү түрлөрүнүн ортосундагы PPA метаболизминин жана өндүрүш гендеринин көптүгүн изилдедик. PPA метаболизмине байланыштуу 1332 гендин ичинен 27 ген контролдук үлгүлөрдө, ал эми 12 ген PPA үлгүлөрүндө көп болгон. PPA өндүрүшүнө байланыштуу 223 гендин ичинен 1 ген PPA үлгүлөрүндө бир топ көп болгон. 6А-сүрөттө PPA метаболизмине катышкан гендердин көптүгү, контролдук үлгүлөрдө бир топ көптүгү жана чоң эффект өлчөмдөрү көрсөтүлгөн, ал эми 6B-сүрөттө PPA үлгүлөрүндө бир топ көптүгү байкалган жеке гендер баса белгиленген.
Сүрөт 6. Чычкандын ичегинин микробиомундагы PPA менен байланышкан гендердин дифференциалдык көптүгү. Жанар тоо графиктеринде PPA метаболизми (A) жана PPA өндүрүшү (B) менен байланышкан гендердин көптүгүндөгү айырмачылыктар көрсөтүлгөн. Боз чекиттер үлгү түрлөрүнүн ортосунда көптүгү анчалык деле айырмаланбаган гендерди көрсөтөт (p-мааниси > 0,05). Түстүү чекиттер көптүктүн олуттуу айырмачылыктарын көрсөтөт (p-мааниси ≤ 0,05). Көптүктүн эң чоң айырмачылыктары бар 20 ген тиешелүүлүгүнө жараша кызыл жана ачык көк түстөрдө (контролдук жана PPA үлгүлөрү) көрсөтүлгөн. Сары жана кочкул кызыл чекиттер контролдук жана PPA үлгүлөрүндө контролдук үлгүлөргө караганда кеминде 2,7 эсе көп болгон. Кара чекиттер орточо CLR айырмачылыктары -1 жана 1 ортосунда болгон бир топ айырмаланган көптүккө ээ гендерди билдирет. P маанилери Манн-Уитни U тести аркылуу эсептелген жана Бенджамини-Хохберг процедурасын колдонуу менен бир нече салыштыруулар үчүн оңдолгон. Гендер ашыкча эмес ген каталогундагы репрезентативдик гендерге туура келет. Гендердин аталыштары KO генин билдирген KEGG символунан турат. Калың орточо CLR айырмачылыктары бир топ айырмаланган көптүктү көрсөтөт. Сызыкча (-) KEGG маалымат базасында ген үчүн эч кандай символ жок экенин билдирет.
PPA метаболизмине жана/же өндүрүшүнө байланыштуу гендери бар таксондор контигдердин таксономиялык окшоштугун гендин контиг идентификатору менен дал келтирүү аркылуу аныкталган. Тукум деңгээлинде 130 урууда PPA метаболизмине байланыштуу гендер жана 61 урууда PPA өндүрүшүнө байланыштуу гендер бар экени аныкталган (4-кошумча таблица). Бирок, бир дагы урууда сан жагынан олуттуу айырмачылыктар байкалган эмес (p > 0,05).
Түр деңгээлинде 144 бактерия түрүндө ППА метаболизми менен байланышкан гендер жана 68 бактерия түрүндө ППА өндүрүү менен байланышкан гендер бар экени аныкталган (5-кошумча таблица). ППА метаболизаторлорунун арасында сегиз бактерия үлгүлөрдүн түрлөрүнүн ортосунда сан жагынан олуттуу өсүштү көрсөттү жана бардыгынын таасири боюнча олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөттү (6-кошумча таблица). Сан жагынан олуттуу айырмачылыктары бар аныкталган бардык ППА метаболизаторлору ППА үлгүлөрүндө көбүрөөк болгон. Түр деңгээлиндеги классификация үлгүлөрдүн түрлөрүнүн ортосунда олуттуу айырмаланбаган уруулардын өкүлдөрүн аныктады, анын ичинде бир нече Bacteroides жана Ruminococcus түрлөрү, ошондой эле Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus жана Alcaligenes polymorpha бар. ППА өндүрүүчү бактериялардын арасында төрт бактерия үлгүлөрдүн түрлөрүнүн ортосунда сан жагынан олуттуу айырмачылыктарды көрсөттү. Сан жагынан олуттуу айырмачылыктары бар түрлөргө Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis жана Ruminococcus bovis кирген.
Бул изилдөөдө биз чычкандардын ичеги микробиотасында PPA таасиринин таасирин изилдедик. PPA бактерияларда ар кандай реакцияларды жаратышы мүмкүн, анткени ал белгилүү бир түрлөр тарабынан өндүрүлөт, башка түрлөр тарабынан азык булагы катары колдонулат же микробго каршы таасирге ээ. Ошондуктан, аны тамак-аш кошулмалары аркылуу ичеги чөйрөсүнө кошуу толеранттуулукка, сезгичтикке жана аны азык булагы катары колдонуу мүмкүнчүлүгүнө жараша ар кандай таасир этиши мүмкүн. Сезимтал бактерия түрлөрү жок кылынып, PPAга туруктуураак же аны азык булагы катары колдоно алгандар менен алмаштырылышы мүмкүн, бул ичеги микробиотасынын курамынын өзгөрүшүнө алып келет. Биздин жыйынтыктар микробдук курамда олуттуу айырмачылыктарды көрсөттү, бирок жалпы микробдук ар түрдүүлүккө эч кандай таасир эткен жок. Эң чоң таасирлер түр деңгээлинде байкалды, PPA жана контролдук үлгүлөрдүн ортосунда 70тен ашык таксондун саны бир топ айырмаланды (2-кошумча таблица). PPA таасир эткен үлгүлөрдүн курамын андан ары баалоо таасир этпеген үлгүлөргө салыштырмалуу микробдук түрлөрдүн гетерогендүүлүгүн жогорулатты, бул PPA бактериялардын өсүү мүнөздөмөлөрүн жакшыртып, PPAга бай чөйрөдө жашай ала турган бактерия популяцияларын чектеши мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Ошентип, PPA ичеги микробиотанын ар түрдүүлүгүнүн кеңири таралышын бузуунун ордуна, өзгөрүүлөрдү тандап алып келиши мүмкүн.
PPA сыяктуу тамак-аш консерванттары мурда жалпы ар түрдүүлүккө таасир этпестен, ичеги микробиомасынын компоненттеринин көптүгүн өзгөртөрү көрсөтүлгөн (Nagpal et al., 2021). Бул жерде биз PPAга дуушар болгон чычкандарда бир топ байытылган Bacteroidetes тибиндеги (мурда Bacteroidetes деп аталган) Bacteroidetes түрлөрүнүн ортосундагы эң таң калыштуу айырмачылыктарды байкадык. Bacteroides түрлөрүнүн көптүгү былжырдын деградациясынын көбөйүшү менен байланыштуу, бул инфекция коркунучун жогорулатып, сезгенүүнү күчөтүшү мүмкүн (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Бир изилдөө Bacteroides fragilis менен дарыланган жаңы төрөлгөн эркек чычкандар аутизм спектринин бузулушун (ASD) эске салган социалдык жүрүм-турумду көрсөтөрүн аныктаган (Carmel et al., 2023), ал эми башка изилдөөлөр Bacteroides түрлөрү иммундук активдүүлүктү өзгөртүп, аутоиммундук сезгенүү кардиомиопатиясына алып келиши мүмкүн экенин көрсөттү (Gil-Cruz et al., 2019). Ruminococcus, Prevotella жана Parabacteroides тукумдарына кирген түрлөр да PPAга дуушар болгон чычкандарда бир кыйла көбөйгөн (Coretti et al., 2018). Айрым Ruminococcus түрлөрү про-сезгенүү цитокиндеринин өндүрүлүшү аркылуу Крон оорусу сыяктуу оорулар менен байланышкан (Henke et al., 2019), ал эми Prevotella humani сыяктуу Prevotella түрлөрү гипертония жана инсулинге сезгичтик сыяктуу зат алмашуу оорулар менен байланышкан (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Акырында, биз Bacteroidetes түрлөрүнүн жалпы саны көп болгондуктан, PPAга дуушар болгон чычкандарда Bacteroidetesтин (мурда Firmicutes деп аталган) Bacteroidetesке болгон катышы контролдук чычкандарга караганда бир топ төмөн экенин аныктадык. Бул катыш мурда ичеги гомеостазынын маанилүү көрсөткүчү катары көрсөтүлгөн жана бул катыштын бузулушу ар кандай оорулардын абалы менен байланыштуу болгон (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), анын ичинде сезгенүү ичеги оорулары (Stojanov et al., 2020). Жалпысынан алганда, Bacteroidetes тибинин түрлөрү тамак-аштагы PPAнын жогорулашынан эң күчтүү жабыркайт окшойт. Бул PPAга жогорку толеранттуулукка же PPAны энергия булагы катары колдонуу мүмкүнчүлүгүнө байланыштуу болушу мүмкүн, бул жок дегенде бир түргө, Hoylesella enoceaга туура келет (Hitch et al., 2022). Же болбосо, эненин PPAга дуушар болушу чычкан тукумдарынын ичегисин Bacteroidetes колонизациясына көбүрөөк сезгич кылуу менен түйүлдүктүн өнүгүүсүн жакшыртышы мүмкүн; бирок, биздин изилдөөнүн дизайны мындай баалоого мүмкүндүк берген жок.
Метагеномикалык мазмунду баалоо PPA метаболизми жана өндүрүшү менен байланышкан гендердин көптүгүндө олуттуу айырмачылыктарды көрсөттү, PPAга дуушар болгон чычкандарда PPA өндүрүшү үчүн жооптуу гендердин көптүгү байкалган, ал эми PPAга дуушар болбогон чычкандарда PAA метаболизми үчүн жооптуу гендердин көптүгү байкалган (6-сүрөт). Бул жыйынтыктар PPAнын микробдук курамга тийгизген таасири аны колдонуудан гана эмес, башкача айтканда, PPA метаболизми менен байланышкан гендердин көптүгү PPAга дуушар болгон чычкандардын ичеги микробиомунда көбүрөөк көптү көрсөтүшү керек болчу. Бир түшүндүрмө, PPA бактериялардын көптүгүн бактериялар тарабынан азык зат катары колдонуу аркылуу эмес, негизинен анын микробго каршы таасири аркылуу ортомчулук кылат. Мурунку изилдөөлөр PPA Salmonella Typhimuriumдун өсүшүн дозага көз каранды түрдө басаңдатарын көрсөттү (Jacobson et al., 2018). PPAнын жогорку концентрациясына дуушар болуу анын микробго каршы касиеттерине туруктуу бактерияларды тандап алышы мүмкүн жана аны метаболиздей же өндүрө албай калышы мүмкүн. Мисалы, бир нече Parabacteroides түрлөрү PPA үлгүлөрүндө бир кыйла көп санда болгон, бирок PPA метаболизмине же өндүрүшүнө байланыштуу гендер табылган эмес (2, 4 жана 5-кошумча таблицалар). Андан тышкары, ачытуунун кошумча продуктусу катары PPA өндүрүшү ар кандай бактериялардын арасында кеңири таралган (Гонсалес-Гарсия жана башкалар, 2017). Бактериялык ар түрдүүлүктүн жогору болушу контролдук үлгүлөрдө PPA метаболизмине байланыштуу гендердин көп санда болушунун себеби болушу мүмкүн (Аверина жана башкалар, 2020). Андан тышкары, 1332 гендин 27си гана (2,14%) PPA метаболизми менен гана байланышкан гендер деп болжолдонгон. PPA метаболизми менен байланышкан көптөгөн гендер башка метаболизм жолдоруна да катышат. Бул PPA метаболизмине катышкан гендердин көптүгү контролдук үлгүлөрдө жогору болгонун дагы бир жолу көрсөтүп турат; бул гендер PPAны кошумча продукт катары колдонууга же пайда кылууга алып келбеген жолдордо иштеши мүмкүн. Бул учурда, PPA генерациясы менен байланышкан бир гана ген үлгү түрлөрүнүн ортосунда көптүктө олуттуу айырмачылыктарды көрсөткөн. PPA метаболизми менен байланышкан гендерден айырмаланып, PPA өндүрүү үчүн маркер гендер тандалып алынган, анткени алар PPA өндүрүүнүн бактериялык жолуна түздөн-түз катышат. PPAга дуушар болгон чычкандарда бардык түрлөрдүн саны жана PPA өндүрүү мүмкүнчүлүгү бир кыйла жогорулаганы аныкталган. Бул PPAлар PPA өндүрүүчүлөрүн тандап, ошондуктан PPA өндүрүү мүмкүнчүлүгү жогорулайт деген божомолду тастыктайт. Бирок, гендердин көптүгү сөзсүз түрдө ген экспрессиясы менен байланыштуу эмес; ошондуктан, PPA метаболизми менен байланышкан гендердин көптүгү контролдук үлгүлөрдө жогору болсо да, экспрессия ылдамдыгы ар кандай болушу мүмкүн (Ши жана башкалар, 2014). PPA өндүрүүчү гендеринин таралышы менен PPA өндүрүшүнүн ортосундагы байланышты ырастоо үчүн, PPA өндүрүүгө катышкан гендердин экспрессиясын изилдөө керек.
PPA жана контролдук метагеномдордун функционалдык аннотациясы айрым айырмачылыктарды көрсөттү. Гендин курамын PCA анализи PPA жана контролдук үлгүлөрдүн ортосундагы дискреттик кластерлерди көрсөттү (5-сүрөт). Үлгү ичиндеги кластерлөө контролдук гендин курамы ар түрдүү экенин, ал эми PPA үлгүлөрү чогуу кластерленгенин көрсөттү. Гендин курамы боюнча кластерлөө түрдүн курамы боюнча кластерлөө менен салыштырууга болот. Ошентип, жолдун көптүгүндөгү айырмачылыктар алардын ичиндеги белгилүү бир түрлөрдүн жана штаммдардын көптүгүндөгү өзгөрүүлөргө дал келет. PPA үлгүлөрүндө бир кыйла көп сандагы эки жол аминокислота/нуклеотиддик канттын алмашуусу (ko:K21279) жана бир нече липиддик алмашуу жолдору (ko:K00647, ko:K03801; Кошумча 3-таблица) менен байланышкан. ko:K21279 менен байланышкан гендер PPA үлгүлөрүндө түрлөрдүн саны бир кыйла көп болгон уруулардын бири болгон Bacteroides уруусу менен байланышканы белгилүү. Бул фермент капсула полисахариддерин экспрессиялоо менен иммундук жооптон кача алат (Wang et al., 2008). Бул PPAга дуушар болгон чычкандарда байкалган бактериоидеттердин көбөйүшүн түшүндүрүшү мүмкүн. Бул PPA микробиомунда байкалган май кислоталарынын синтезинин жогорулашын толуктайт. Бактериялар май кислоталарын өндүрүү үчүн FASIIko:K00647 (fabB) жолун колдонушат, бул кожоюндун зат алмашуу жолдоруна таасир этиши мүмкүн (Yao жана Rock, 2015; Johnson et al., 2020), ал эми липиддик алмашуунун өзгөрүшү нейроөнүгүүдө роль ойношу мүмкүн (Yu et al., 2020). PPA үлгүлөрүндө көбөйгөн санды көрсөткөн дагы бир жол стероиддик гормондордун биосинтези болгон (ko:K12343). Ичеги микробиотасынын гормондордун деңгээлине таасир этүү жана гормондордун таасири астында болуу жөндөмүнүн ортосунда тескери байланыш бар экендиги жөнүндө далилдер көбөйүүдө, мисалы, стероиддердин деңгээлинин жогорулашы ден соолукка терс таасирин тийгизиши мүмкүн (Tetel et al., 2018).
Бул изилдөө чектөөлөрсүз жана эске алуучу жагдайларсыз эмес. Маанилүү айырмачылык - биз жаныбарлардын физиологиялык баалоолорун жүргүзгөн жокпуз. Ошондуктан, микробиомдогу өзгөрүүлөр кандайдыр бир оору менен байланыштуубу же жокпу, түз жыйынтык чыгаруу мүмкүн эмес. Дагы бир эске алуучу жагдай, бул изилдөөдөгү чычкандар энелери менен бирдей диета менен азыктанышкан. Келечектеги изилдөөлөр PPAга бай диетадан PPAсыз диетага өтүү анын микробиомго тийгизген таасирин жакшыртабы же жокпу, аныктай алат. Биздин изилдөөнүн бир чектөөсү, башка көптөгөн изилдөөлөр сыяктуу эле, чектелген үлгү көлөмү. Жарактуу тыянактарды чыгарууга мүмкүн болсо да, чоңураак үлгү көлөмү жыйынтыктарды талдоодо көбүрөөк статистикалык күч берет. Ошондой эле, ичеги микробиомундагы өзгөрүүлөр менен кандайдыр бир оорунун ортосундагы байланыш жөнүндө тыянак чыгарууда этият болобуз (Yap et al., 2021). Жаш курагы, жынысы жана диетасы сыяктуу чаташтыруучу факторлор микроорганизмдердин курамына олуттуу таасир этиши мүмкүн. Бул факторлор ичеги микробиомунун татаал оорулар менен байланышы боюнча адабиятта байкалган карама-каршылыктарды түшүндүрүшү мүмкүн (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Мисалы, Bacteroidetes тукумунун мүчөлөрү ASD менен ооруган жаныбарларда жана адамдарда көбөйгөнү же азайганы көрсөтүлгөн (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Ошо сыяктуу эле, сезгенүү ичеги оорулары бар бейтаптардын ичегинин курамын изилдөө бир эле таксондордо көбөйүүнү да, азайууну да аныктаган (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Гендердик бир жактуулуктун таасирин чектөө үчүн, биз жыныстардын бирдей өкүлчүлүгүн камсыз кылууга аракет кылдык, ошондуктан айырмачылыктар, кыязы, диета менен шартталган. Функционалдык аннотациянын бир кыйынчылыгы - ашыкча ген ырааттуулуктарын алып салуу. Биздин гендерди кластерлөө ыкмабыз жалган кластерлөөнү жок кылуу үчүн 95% ырааттуулук окшоштугун жана 85% узундук окшоштугун, ошондой эле 90% тегиздөөнү камтууну талап кылат. Бирок, кээ бир учурларда, биз бирдей аннотациялары бар COGдерди байкадык (мисалы, MUT) (6-сүрөт). Бул ортологдордун айырмаланарын, белгилүү бир уруулар менен байланышканын же бул гендерди кластерлөө ыкмасынын чектөөсү экенин аныктоо үчүн кошумча изилдөөлөр талап кылынат. Функционалдык аннотациянын дагы бир чектөөсү - бул мүмкүн болгон туура эмес классификация; mmdA бактериялык гени пропионат синтезине катышкан белгилүү фермент, бирок KEGG аны пропионаттын метаболизм жолу менен байланыштырбайт. Ал эми scpB жана mmcD ортологдору бири-бирине байланыштуу. Белгиленген нокаутсуз гендердин көп саны гендердин көптүгүн баалоодо PPAга байланыштуу гендерди аныктоого мүмкүн эместигине алып келиши мүмкүн. Келечектеги изилдөөлөр метатранскриптом анализинен пайда алат, ал ичеги микробиотанын функционалдык мүнөздөмөлөрүн тереңирээк түшүнүүгө жана ген экспрессиясын потенциалдуу кийинки таасирлер менен байланыштырууга мүмкүндүк берет. Белгилүү бир нейроөнүгүү бузулууларын же ичеги сезгенүү ооруларын камтыган изилдөөлөр үчүн микробиомдун курамындагы өзгөрүүлөрдү бул бузулуулар менен байланыштыруу үчүн жаныбарлардын физиологиялык жана жүрүм-турумдук баалоолору керек. Микробиом оорунун кыймылдаткычы же мүнөзү экенин аныктоо үчүн ичеги микробиомасын микробсуз чычкандарга көчүрүү боюнча кошумча изилдөөлөр да пайдалуу болмок.
Кыскасы, биз диеталык PPA ичеги микробиотанын курамын өзгөртүүчү фактор катары иштээрин көрсөттүк. PPA - бул FDA тарабынан бекитилген ар кандай азыктарда кеңири таралган консервант, ал узак мөөнөттүү таасир эткенде кадимки ичеги флорасынын бузулушуна алып келиши мүмкүн. Биз бир нече бактериялардын көптүгүндөгү өзгөрүүлөрдү таптык, бул PPA ичеги микробиотанын курамына таасир этиши мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Микробиотанын өзгөрүшү белгилүү бир зат алмашуу жолдорунун деңгээлинин өзгөрүшүнө алып келиши мүмкүн, бул кожоюндун ден соолугуна тиешелүү физиологиялык өзгөрүүлөргө алып келиши мүмкүн. Диеталык PPAнын микробдук курамга тийгизген таасири дисбактериозго же башка ооруларга алып келиши мүмкүнбү же жокпу, аныктоо үчүн андан ары изилдөөлөр талап кылынат. Бул изилдөө PPAнын ичеги курамына тийгизген таасири адамдын ден соолугуна кандай таасир этиши мүмкүн экендиги боюнча келечектеги изилдөөлөр үчүн негиз түзөт.
Бул изилдөөдө берилген маалыматтар топтомдору онлайн репозиторийлерде жеткиликтүү. Репозитордун аталышы жана кирүү номери: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Бул жаныбарларды изилдөө Борбордук Флорида Университетинин Жаныбарларды багуу жана пайдалануу боюнча институттук комитети (UCF-IACUC) тарабынан бекитилген (Жаныбарларды пайдаланууга уруксаттын номери: PROTO202000002). Бул изилдөө жергиликтүү мыйзамдарга, жоболорго жана институттук талаптарга жооп берет.
NG: Концептуалдаштыруу, Маалыматтарды тандоо, Формалдуу талдоо, Изилдөө, Методология, Программалык камсыздоо, Визуалдаштыруу, Жазуу (баштапкы долбоор), Жазуу (карап чыгуу жана түзөтүү). LA: Концептуалдаштыруу, Маалыматтарды тандоо, Методология, Ресурстар, Жазуу (карап чыгуу жана түзөтүү). SH: Формалдуу талдоо, Программалык камсыздоо, Жазуу (карап чыгуу жана түзөтүү). SA: Изилдөө, Жазуу (карап чыгуу жана түзөтүү). Башкы судья: Изилдөө, Жазуу (карап чыгуу жана түзөтүү). SN: Концептуалдаштыруу, Долбоорду башкаруу, Ресурстар, Көзөмөлдөө, Жазуу (карап чыгуу жана түзөтүү). TA: Концептуалдаштыруу, Долбоорду башкаруу, Көзөмөлдөө, Жазуу (карап чыгуу жана түзөтүү).
Авторлор бул макаланы изилдөө, автордук кылуу жана/же жарыялоо үчүн эч кандай каржылык колдоо албагандыктарын билдиришти.
Авторлор изилдөө кызыкчылыктардын кагылышуусу катары чечмелениши мүмкүн болгон эч кандай коммерциялык же каржылык мамилелер жок болгон учурда жүргүзүлгөнүн билдиришет жана бул тиешелүү эмес.
Бул макалада айтылган бардык пикирлер авторлордун гана пикири болуп саналат жана сөзсүз түрдө алардын мекемелеринин, басмаканаларынын, редакторлорунун же сынчыларынын көз караштарын чагылдырбайт. Бул макалада бааланган ар кандай продукциялар же аларды өндүрүүчүлөр тарабынан айтылган ар кандай дооматтар басмакана тарабынан кепилденбейт же колдоого алынбайт.
Бул макала үчүн кошумча материалдарды онлайн режиминде тапса болот: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абделли Л.С., Самсам А., Нассер С.А. (2019). Пропион кислотасы аутизм спектринин бузулууларында PTEN/AKT жолун жөнгө салуу менен глиозду жана нейросезгенүүнү пайда кылат. Илимий отчеттор 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Айтчисон, Дж. (1982). Курамдык маалыматтардын статистикалык анализи. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ан Ж., Квон Х., Ким Й.Ж. (2023). Эмчек рагынын коркунуч фактору катары фирмикуттар/бактериоидеттер катышы. Клиникалык медицина журналы, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андерс С., Хубер В. (2010). Ырааттуулук саноо маалыматтарынын дифференциалдык экспрессиясын талдоо. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Анжелис, MD, Пикколо, М., Ваннини, Л., Сирагуса, С., Джакомо, А.Д., Серразанетти, Д.И. жана башкалар. (2013). Аутизм жана башка жагынан көрсөтүлбөгөн кеңири таралган өнүгүү бузулуусу бар балдардын фекалдык микробиотасы жана метаболомасы. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверина О.В., Ковтун А.С., Полякова С.И., Савилова А.М., Ребриков Д.В., Даниленко В.Н. (2020). Аутизм спектринин бузулушу бар жаш балдардын ичеги микробиотасынын бактериялык нейрометаболикалык мүнөздөмөлөрү. Медициналык микробиология журналы 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Микробиом адам органы катары. Клиникалык микробиология жана инфекция 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баур Т., Дюрре П. (2023). Пропион кислотасын өндүрүүчү бактериялардын физиологиясына жаңы көз караштар: Anaerotignum propionicum жана Anaerotignum neopropionicum (мурдагы Clostridium propionicum жана Clostridium neopropionicum). Микроорганизмдер 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Bazer FW, Spencer TE, Wu G, Cudd TA, Meininger SJ (2004). Эненин тамактануусу жана түйүлдүктүн өнүгүүсү. J Nutr. 134, 2169–2172. doi: 10.1093/jn/134.9.2169
Benjamini, Y., жана Hochberg, J. (1995). Жалган оң көрсөткүчтөрдү көзөмөлдөө: Көп жолу тестирлөөгө практикалык жана натыйжалуу мамиле. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x