Иммуномодулятордук метаболиттер шишиктин микрочөйрөсүнүн (TME) негизги өзгөчөлүгү болуп саналат, бирок бир нече өзгөчөлүктөрдү эске албаганда, алардын ким экендиги белгисиз бойдон калууда. Бул жерде биз жогорку класстагы сероздук карцинома (HGSC) менен ооругандардын шишиктеринен жана асцитинен шишиктерди жана Т клеткаларын талдап, бул ар кандай TME бөлүмдөрүнүн метаболомун аныктадык. Асцит жана шишик клеткалары метаболиттерде чоң айырмачылыктарга ээ. Асцит менен салыштырганда, шишикке инфильтрацияланган Т клеткалары 1-метилникотинамидге (MNA) бир кыйла бай. Т клеткаларындагы MNA деңгээли жогору болгону менен, никотинамид N-метилтрансферазасынын (S-аденозилметиониндан никотинамидге метил топторунун өтүшүн катализдөөчү фермент) экспрессиясы фибробласттар жана шишик клеткалары менен гана чектелет. Функционалдык жактан MNA Т клеткаларын шишикти күчөтүүчү цитокин шишик некрозунун альфа факторун бөлүп чыгарууга түрткү берет. Ошондуктан, TMEден алынган MNA Т клеткаларынын иммундук жөнгө салынышына салым кошот жана адамдын рак оорусун дарылоо үчүн потенциалдуу иммунотерапиянын бутасын билдирет.
Шишиктен алынган метаболиттер шишикке каршы иммунитетке терең ингибирлөөчү таасир тийгизиши мүмкүн жана барган сайын көбүрөөк далилдер алардын оорунун өнүгүшүнүн негизги кыймылдаткыч күчү катары кызмат кыла аларын көрсөтүп турат (1). Варбург эффектинен тышкары, шишик клеткаларынын зат алмашуу абалын жана анын шишик микрочөйрөсүнүн (TME) иммундук абалы менен болгон байланышын мүнөздөө боюнча акыркы иштер башталды. Чычкан моделдери жана адамдын Т-клеткалары боюнча изилдөөлөр глутамин метаболизми (2), кычкылдануу метаболизми (3) жана глюкоза метаболизми (4) ар кандай иммундук клеткалардын кичи топторуна көз карандысыз таасир эте аларын көрсөттү. Бул жолдордогу бир нече метаболиттер Т-клеткаларынын шишикке каршы функциясын ингибирлейт. Тетрагидробиоптерин (BH4) коферментинин блокадасы Т-клеткаларынын көбөйүшүнө зыян келтириши мүмкүн экени жана организмде BH4 көбөйүшү CD4 жана CD8 аркылуу шишикке каршы иммундук жоопту күчөтүшү мүмкүн экени далилденген. Мындан тышкары, кинурениндин иммуносупрессивдүү таасирин BH4 киргизүү менен сактап калууга болот (5). Изоцитратдегидрогеназа (IDH) мутант глиобластомасында энантиометаболикалык (R)-2-гидроксиглютараттын (R-2-HG) бөлүнүп чыгышы Т-клеткалардын активдешүүсүн, көбөйүшүн жана цитолиз активдүүлүгүн басаңдатат (6). Жакында эле гликолиздин кошумча продуктусу болгон метилглиоксал миелоиддик келип чыккан супрессордук клеткалар тарабынан өндүрүлүп, метилглиоксалдын Т-клетка аркылуу өткөрүлүшү эффектордук Т-клетка функциясын басаңдата алары көрсөтүлдү. Дарылоодо метилглиоксалдын нейтралдашуусу миелоиддик келип чыккан супрессордук клеткалардын (MDSC) активдүүлүгүн жеңип, чычкан моделдеринде текшерүү пункттарын блокадалоо терапиясын синергетикалык жактан күчөтө алат (7). Бул изилдөөлөр жалпысынан Т-клетка функциясын жана активдүүлүгүн жөнгө салууда ТМЕден алынган метаболиттердин негизги ролун баса белгилейт.
Т-клеткалардын дисфункциясы энелик бездин рагында кеңири катталган (8). Бул жарым-жартылай гипоксияга жана шишиктин кан тамырларынын анормалдуулугуна байланыштуу (9), бул глюкоза менен триптофандын сүт кислотасы жана кинуренин сыяктуу кошумча продуктуларга айлануусуна алып келет. Ашыкча клеткадан тышкаркы лактат интерферон-γ (IFN-γ) өндүрүшүн азайтат жана миелосупрессивдүү кичи топтордун дифференциациясын шарттайт (10, 11). Триптофанды керектөө Т-клеткалардын көбөйүшүн түздөн-түз басаңдатат жана Т-клетка рецепторлорунун сигнализациясын басаңдатат (12-14). Бул байкоолорго карабастан, иммундук метаболизмди өнүктүрүү боюнча көптөгөн иштер in vitro Т-клетка культурасында оптималдаштырылган чөйрөнү колдонуу менен жүргүзүлдү же in vivo гомологиялык чычкан моделдери менен гана чектелди, алардын бири да адамдын рак ооруларынын гетерогендүүлүгүн жана физиологиялык макро жана микро чөйрөнүн гетерогендүүлүгүн толук чагылдырбайт.
Энелик бездин рагынын кеңири таралган белгиси - перитонеалдык жайылышы жана асциттин пайда болушу. Асцитте клетка суюктугунун топтолушу оорунун өнүгүшү жана начар прогноз менен байланыштуу (15). Маалыматтарга ылайык, бул уникалдуу бөлүк гипоксиялык, кан тамыр эндотелийинин өсүү факторунун (VEGF) жана индоламин 2,3-диоксигеназанын (IDO) жогорку деңгээлине ээ жана Т-жөнгө салуучу клеткалар жана миелоиддик ингибирлөөчү клеткалар тарабынан инфильтрацияланат (15-18). Асциттин зат алмашуу чөйрөсү шишиктин өзүнөн айырмаланышы мүмкүн, ошондуктан перитонеалдык мейкиндиктеги Т клеткаларынын кайра программаланышы белгисиз. Мындан тышкары, шишик чөйрөсүндө болгон асцит менен метаболиттердин ортосундагы негизги айырмачылыктар жана гетерогендүүлүк иммундук клеткалардын инфильтрациясына жана алардын шишиктердеги функциясына тоскоол болушу мүмкүн, ошондуктан андан ары изилдөө жүргүзүү зарыл.
Бул көйгөйлөрдү чечүү үчүн биз ар кандай клетка түрлөрүн (CD4 + жана CD8 + Т клеткаларын кошо алганда), ошондой эле шишиктердин ичинде жана ортосунда изилдөө үчүн сезгич клеткаларды бөлүү жана суюк хроматография тандемдик массалык спектрометрия (LC-MS/MS) ыкмасын иштеп чыктык. Анын метаболиттери бейтаптын ошол эле асцит жана шишик чөйрөсүндөгү клеткаларды камтыйт. Бул ыкманы биз жогорку өлчөмдүү агым цитометриясы жана бир клеткалуу РНК секвенирлөө (scRNA-seq) менен биргеликте колдонуп, бул негизги популяциялардын зат алмашуу абалынын жогорку деңгээлде чечилген портретин беребиз. Бул ыкма шишиктин Т клеткаларында 1-метилникотинамиддин (MNA) деңгээлинин олуттуу жогорулаганын көрсөттү жана in vitro эксперименттер MNAнын Т клеткасынын функциясына иммуномодулятордук таасири мурда белгисиз болгонун көрсөттү. Жалпысынан алганда, бул ыкма шишиктер менен иммундук клеткалардын ортосундагы өз ара зат алмашуу өз ара аракеттенүүсүн ачып берет жана иммундук жөнгө салуу метаболиттери жөнүндө уникалдуу түшүнүктөрдү берет, бул Т клеткаларына негизделген энелик без рагын иммунотерапия менен дарылоо мүмкүнчүлүктөрүн дарылоодо пайдалуу болушу мүмкүн.
Биз глюкозанын сиңүүсүн бир эле учурда сандык жактан аныктоо үчүн жогорку өлчөмдүү агым цитометриясын колдондук [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) жана митохондриялык активдүүлүк [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) иммундук клеткаларды жана шишик клеткаларынын популяцияларын айырмалаган жанаша турган типтүү маркерлер (S2 таблицасы жана S1A сүрөтү). Бул анализ Т-клеткаларына салыштырмалуу асцит жана шишик клеткаларынын глюкозанын сиңүү деңгээли жогору экенин, бирок митохондриялык активдүүлүктө айырмачылыктар азыраак экенин көрсөттү. Шишик клеткаларынын [CD45-EpCAM (EpCAM)+] орточо глюкозанын сиңүүсү Т-клеткаларына караганда үч-төрт эсе көп, ал эми CD4 + Т-клеткаларынын орточо глюкозанын сиңүүсү CD8 + Т-клеткаларына караганда 1,2 эсе көп, бул шишикке инфильтрацияланган лимфоциттердин (TIL) бир эле TMEде да ар кандай зат алмашуу талаптары бар экенин көрсөтүп турат (1A сүрөт). Ал эми шишик клеткаларындагы митохондриялык активдүүлүк CD4 + Т клеткаларыныкына окшош жана эки клетка түрүнүн митохондриялык активдүүлүгү CD8 + Т клеткаларыныкына караганда жогору (1B-сүрөт). Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар зат алмашуу деңгээлин көрсөтөт. Шишик клеткаларынын зат алмашуу активдүүлүгү CD4 + Т клеткаларыныкына караганда жогору, ал эми CD4 + Т клеткаларынын зат алмашуу активдүүлүгү CD8 + Т клеткаларыныкына караганда жогору. Клетка түрлөрү боюнча бул таасирлерге карабастан, CD4 + жана CD8 + Т клеткаларынын зат алмашуу абалында же алардын шишиктер менен салыштырганда асциттеги салыштырмалуу пропорцияларында эч кандай ырааттуу айырмачылык жок (1C-сүрөт). Ал эми CD45-клетка фракциясында шишиктеги EpCAM+ клеткаларынын үлүшү асцит менен салыштырганда жогорулаган (1D-сүрөт). Ошондой эле, EpCAM+ жана EpCAM-клетка компоненттеринин ортосундагы айкын зат алмашуу айырмасын байкадык. EpCAM+ (шишик) клеткаларында EpCAM-клеткаларына караганда глюкозанын сиңирилиши жана митохондриялык активдүүлүк жогору, бул TMEдеги шишик клеткаларындагы фибробласттардын зат алмашуу активдүүлүгүнөн алда канча жогору (1-сүрөт, E жана F-сүрөт).
(A жана B) Глюкозанын сиңирилишинин (2-NBDG) орточо флуоресценция интенсивдүүлүгү (MFI) (A) жана CD4 + Т клеткаларынын митохондриялык активдүүлүгү (MitoTracker кочкул кызыл) (B) Өкүлчүлүктүү графиктер (солдо) жана таблицадагы маалыматтар (оңдо), асциттен жана шишиктен алынган CD8 + Т клеткаларынын жана EpCAM + CD45-шишик клеткаларынын катышы. (C) Асцитте жана шишиктеги CD4 + жана CD8 + клеткаларынын (CD3 + Т клеткаларынын) катышы. (D) Асцитте жана шишиктеги (CD45−) EpCAM + шишик клеткаларынын үлүшү. (E жана F) EpCAM + CD45-шишик жана EpCAM-CD45-матрица глюкозанын сиңирилиши (2-NBDG) (E) жана митохондриялык активдүүлүк (MitoTracker кочкул кызыл) (F) Өкүлчүлүктүү графиктер (солдо) жана таблицадагы маалыматтар (Оңдо) Асциттер жана шишик клеткалары. (G) Агым цитометриясы аркылуу CD25, CD137 жана PD1 экспрессиясынын өкүлчүлүктүү графиктери. (H жана I) CD4 + Т клеткаларындагы (H) жана CD8 + Т клеткаларындагы (I) CD25, CD137 жана PD1 экспрессиясы. (J жана K) CCR7 жана CD45RO экспрессиясына негизделген наивдүү, борбордук эс тутум (Tcm), эффектордук (Teff) жана эффектордук эс тутум (Tem) фенотиптери. Асцит жана шишиктердеги CD4 + Т клеткаларынын (J) жана CD8 + Т клеткаларынын (K) репрезентативдик сүрөттөрү (солдо) жана таблицалык маалыматтар (оңдо). P маанилери жупташкан t-тест менен аныкталат (*P<0.05, **P<0.01 жана ***P<0.001). Сызык дал келген бейтаптарды билдирет (n = 6). FMO, флуоресценция минус бир; MFI, флуоресценциянын орточо интенсивдүүлүгү.
Андан ары талдоо жогорку деңгээлде чечилген Т-клеткасынын фенотиптик абалынын ортосундагы башка маанилүү айырмачылыктарды аныктады. Шишиктердеги активдештирилген (1-сүрөт, G дан I га чейин) жана эффектордук эс тутум (1-сүрөт, J жана K) асцитке (CD3 + Т-клеткаларынын үлүшү) караганда алда канча көп кездешет. Ошо сыяктуу эле, активдештирүү маркерлеринин (CD25 жана CD137) жана азайуу маркерлеринин [программаланган клетка өлүмүнүн протеини 1 (PD1)] экспрессиясы боюнча фенотипти талдоо бул популяциялардын зат алмашуу мүнөздөмөлөрү ар башка болгону менен (S1, B дан E га чейин), бирок наив, эффектордук же эс тутум субтопторунун ортосунда эч кандай олуттуу зат алмашуу айырмачылыктары байкалган эмес (S1, F дан I га чейин). Бул жыйынтыктар клетка фенотиптерин автоматтык түрдө дайындоо үчүн машиналык окутуу ыкмаларын колдонуу менен тастыкталды (21), бул андан ары бейтаптын асцитинде көп сандаган жилик чучугу клеткаларынын (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) бар экендигин аныктады (S2A-сүрөт). Бардык аныкталган клетка түрлөрүнүн ичинен бул миелоиддик клетка популяциясы глюкозанын сиңирилишин жана митохондриялык активдүүлүктү эң жогорку деңгээлде көрсөттү (S2, B дан G га чейинки сүрөт). Бул жыйынтыктар HGSC бейтаптарындагы асцит жана шишиктерде кездешкен бир нече клетка түрлөрүнүн ортосундагы күчтүү метаболикалык айырмачылыктарды баса белгилейт.
TILдин метабономикалык мүнөздөмөлөрүн түшүнүүдөгү негизги кыйынчылык - шишиктерден жетиштүү тазалыктагы, сапаттагы жана сандагы Т-клетка үлгүлөрүн бөлүп алуу зарылдыгы. Акыркы изилдөөлөр агым цитометриясына негизделген сорттоо жана мончокторду байытуу ыкмалары клеткалык метаболит профилдеринин өзгөрүшүнө алып келиши мүмкүн экенин көрсөттү (22-24). Бул көйгөйдү чечүү үчүн, биз LC-MS/MS аркылуу анализ жүргүзүүдөн мурун хирургиялык жол менен алынып салынган адамдын энелик безинин рагынан TILди бөлүп алуу жана бөлүп алуу үчүн мончокторду байытуу ыкмасын оптималдаштырдык (Материалдар жана методдорду караңыз; 2A-сүрөт). Бул протоколдун метаболиттердин өзгөрүшүнө жалпы таасирин баалоо үчүн, биз жогорудагы мончокторду бөлүү кадамынан кийин дени сак донорлор тарабынан активдештирилген Т-клеткалардын метаболит профилдерин мончоктор менен бөлүнбөгөн, бирок музда калган клеткалар менен салыштырдык. Бул сапатты көзөмөлдөө анализи бул эки шарттын ортосунда жогорку корреляция бар экенин (r = 0,77) жана 86 метаболиттен турган топтун техникалык кайталануучулугу жогорку кайталануучулукка ээ экенин көрсөттү (2B-сүрөт). Ошондуктан, бул ыкмалар клетка түрүн байытууда турган клеткаларда метаболиттерди так анализдөөнү жүргүзө алат, ошону менен HGSCдеги белгилүү бир метаболиттерди аныктоо үчүн биринчи жогорку чечилиштеги платформаны камсыз кылат, ошону менен адамдарга клетканын өзгөчөлүгүн тереңирээк түшүнүүгө мүмкүндүк берет. Жыныстык метаболизм программасы.
(A) Магниттик мончокторду байытуунун схемалык диаграммасы. LC-MS/MS аркылуу анализ жүргүзүүдөн мурун, клеткалар магниттик мончокторду байытуунун үч катары менен айлампасынан өтөт же музда калат. (B) Байытуу түрүнүн метаболиттердин көптүгүнө тийгизген таасири. Ар бир байытуу түрү үчүн үч өлчөөнүн орточо мааниси ± SE. Боз сызык 1:1 байланышын билдирет. Октук этикеткада көрсөтүлгөн кайталанган өлчөөлөрдүн класс ичиндеги корреляциясы (ICC). NAD, никотинамид аденин динуклеотиди. (C) Бейтаптын метаболиттерди талдоо жумуш агымынын схемалык диаграммасы. Асциттер же шишиктер бейтаптардан чогултулуп, криоконсервацияланат. Ар бир үлгүнүн кичинекей бөлүгү агым цитометриясы менен талданган, ал эми калган үлгүлөр CD4+, CD8+ жана CD45- клеткалары үчүн үч жолу байытууга дуушар болгон. Бул клетка фракциялары LC-MS/MS колдонуу менен талданган. (D) Стандартташтырылган метаболиттердин көптүгүнүн жылуулук картасы. Дендрограмма үлгүлөрдүн ортосундагы Евклид аралыктарынын Уорддун кластерин билдирет. (E) Ар бир үлгүнүн үч кайталанышын көрсөткөн үлгү метаболит картасынын негизги компоненттик анализи (PCA), бир эле бейтаптан алынган үлгүлөр сызык менен туташтырылган. (F) Бейтапка шартталган үлгүнүн метаболит профилинин PCAсы (б.а., жарым-жартылай ашыкча колдонуу); үлгүнүн түрү томпок кабык менен чектелген. PC1, негизги компонент 1; PC2, негизги компонент 2.
Андан кийин, биз бул байытуу ыкмасын алты HGSC бейтапынын баштапкы асциттериндеги жана шишиктериндеги CD4+, CD8+ жана CD45-клетка фракцияларындагы 99 метаболитти талдоо үчүн колдондук (2C-сүрөт, S3A-сүрөт жана S3 жана S4 таблицалары). Кызыкчылык жараткан популяция тирүү клеткалардын баштапкы чоң үлгүсүнүн 2% дан 70% га чейин түзөт жана клеткалардын үлүшү бейтаптардын ортосунда абдан айырмаланат. Мончокторду бөлгөндөн кийин, байытылган кызыкчылык бөлүгү (CD4+, CD8+ же CD45-) үлгүдөгү бардык тирүү клеткалардын орточо эсеп менен 85% дан ашыгын түзөт. Бул байытуу ыкмасы бизге чоң үлгүлөрдөн жасоо мүмкүн болбогон адамдын шишик ткандарынын метаболизминен клетка популяцияларын талдоого мүмкүндүк берет. Бул протоколду колдонуп, биз l-кинуренин жана аденозин, бул эки жакшы мүнөздөлгөн иммуносупрессивдүү метаболиттер шишиктин Т клеткаларында же шишик клеткаларында жогорулаганын аныктадык (S3, B жана C-сүрөттөр). Ошондуктан, бул жыйынтыктар биздин клеткаларды бөлүү жана массалык спектрометрия технологиясынын бейтаптын ткандарында биологиялык жактан маанилүү метаболиттерди табуудагы тактыгын жана жөндөмүн көрсөтөт.
Биздин анализ ошондой эле бейтаптардын ичинде жана ортосунда клетка түрлөрүнүн күчтүү метаболикалык бөлүнүшүн көрсөттү (2D-сүрөт жана S4A-сүрөт). Атап айтканда, башка бейтаптар менен салыштырганда, 70-бейтап ар кандай метаболикалык мүнөздөмөлөрдү көрсөттү (2E-сүрөт жана S4B-сүрөт), бул бейтаптардын ортосунда олуттуу метаболикалык гетерогендүүлүк болушу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. Белгилей кетүүчү нерсе, башка бейтаптар менен салыштырганда (1,2ден 2 литрге чейин; S1-таблица), 70-бейтапта чогултулган асциттин жалпы көлөмү (80 мл) аз болгон. Негизги компонентти талдоо учурунда (мисалы, жарым-жартылай ашыкча анализди колдонуу менен) бейтаптардын ортосундагы гетерогендүүлүктү көзөмөлдөө клетка түрлөрүнүн ортосундагы ырааттуу өзгөрүүлөрдү көрсөтөт жана клетка түрлөрү жана/же микрочөйрө метаболит профилине ылайык так агрегацияланган (2F-сүрөт). Бир метаболиттерди талдоо бул эффекттерди баса белгилеп, клетка түрлөрү менен микрочөйрөнүн ортосундагы олуттуу айырмачылыктарды көрсөттү. Белгилей кетүүчү нерсе, байкалган эң чоң айырмачылык - бул MNA, ал адатта CD45-клеткаларда жана шишикке инфильтрацияланган CD4+ жана CD8+ клеткаларында байытылган (3A-сүрөт). CD4+ клеткалары үчүн бул таасир эң айкын көрүнөт жана CD8+ клеткаларындагы MNA да айлана-чөйрөнүн таасирине катуу дуушар болгондой сезилет. Бирок, бул маанилүү эмес, анткени алты бейтаптын үчөө гана шишиктин CD8+ упайлары боюнча бааланышы мүмкүн. MNAдан тышкары, асцит жана шишиктердеги ар кандай типтеги клеткаларда TILде начар мүнөздөлгөн башка метаболиттер да ар кандай деңгээлде бай (S3 жана S4 сүрөттөрү). Ошондуктан, бул маалыматтар андан ары изилдөө үчүн келечектүү иммуномодулятордук метаболиттердин жыйындысын ачып берет.
(A) Асцит жана шишиктен алынган CD4+, CD8+ жана CD45- клеткаларындагы MNAнын нормалдаштырылган курамы. Кутуча диаграммасында медиана (сызык), квартил аралык диапазон (рамка шарнири) жана маалыматтар диапазону квартил аралык диапазондон (рамка шарнири) 1,5 эсеге чейин көрсөтүлгөн. "Бейтаптын материалдары жана методдору" бөлүмүндө сүрөттөлгөндөй, P маанисин аныктоо үчүн бейтаптын лимма маанисин колдонуңуз (*P<0,05 жана **P<0,01). (B) MNA метаболизминин схемалык диаграммасы (60). Метаболиттер: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибозасы; NMN, никотинамид мононуклеотиди. Ферменттер (жашыл): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуиндер; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансфераза; AOX1, альдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид мононуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилазасы. (C) Асциттин (боз) жана шишиктин scRNA-секвенциясынын t-SNEси (кызыл; n = 3 бейтап). (D) scRNA-секвенциясын колдонуу менен аныкталган ар кандай клетка популяцияларындагы NNMT экспрессиясы. (E) SK-OV-3, адамдын эмбриондук бөйрөгүнүн (HEK) 293T, Т клеткаларында жана MNA менен дарыланган Т клеткаларында NNMT жана AOX1 экспрессиясы. Бүктөлгөн экспрессия SK-OV-3кө салыштырмалуу көрсөтүлгөн. SEM менен экспрессия схемасы көрсөтүлгөн (n = 6 дени сак донор). 35тен жогору Ct маанилери аныкталбайт деп эсептелет (UD). (F) SK-OV-3, HEK293T, Т клеткаларында жана 8 мМ MNA менен иштетилген Т клеткаларында SLC22A1 жана SLC22A2 экспрессиясы. Бүктөлгөн экспрессия SK-OV-3кө салыштырмалуу көрсөтүлгөн. SEM менен экспрессия схемасы көрсөтүлгөн (n = 6 дени сак донор). 35тен жогору Ct маанилери аныкталбайт деп эсептелет (UD). (G) MNA менен 72 сааттык инкубациядан кийин активдештирилген дени сак донор Т клеткаларындагы клетка MNA курамы. SEM менен экспрессия схемасы көрсөтүлгөн (n = 4 дени сак донор).
MNA метил тобун S-аденозил-1-метионинден (SAM) никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; 3B-сүрөт) аркылуу никотинамидге (NA) которуу жолу менен өндүрүлөт. NNMT ар кандай адам рак ооруларында ашыкча экспрессияланат жана пролиферация, инвазия жана метастаз менен байланыштуу (25-27). TMEдеги Т-клеткаларындагы MNA булагын жакшыраак түшүнүү үчүн, биз үч HGSC бейтапынын асцит жана шишиктериндеги клетка түрлөрү боюнча NNMT экспрессиясын мүнөздөө үчүн scRNA-seq колдондук (S5-таблица). Болжол менен 6500 клетканы талдоо асцит жана шишик чөйрөсүндө NNMT экспрессиясы болжолдонгон фибробласт жана шишик клеткаларынын популяциялары менен чектелгенин көрсөттү (3-сүрөт, C жана D). Белгилей кетүүчү нерсе, PTPRC (CD45+) экспрессиялаган эч бир популяцияда NNMT экспрессиясы жок (3D-сүрөт жана S5A-сүрөт), бул метаболит спектринде аныкталган MNA Т-клеткаларга киргизилгенин көрсөтүп турат. Альдегид оксидаза 1 (AOX1) экспрессиясы MNAны 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамидге (2-PYR) же 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамидге (4-PYR) айландырат; 3B-сүрөт) ошондой эле COL1A1 экспрессиялаган фибробласттардын популяциясы менен гана чектелет (S5A-сүрөт), бул чогуу алганда Т-клеткалардын салттуу MNA метаболизми жөндөмү жок экенин көрсөтөт. Бул MNAга байланыштуу гендердин экспрессия схемасы HGSC бейтаптарынын асциттеринен алынган экинчи көз карандысыз клетка маалыматтарынын топтомун колдонуу менен текшерилген (S5B-сүрөт; n = 6) (16). Мындан тышкары, MNA менен дарыланган дени сак донордук Т-клеткалардын сандык полимераз чынжыр реакциясы (qPCR) анализи SK-OV-3 энелик бездин шишик клеткаларына салыштырмалуу NNMT же AOX1 дээрлик экспрессияланбаганын көрсөттү (3E-сүрөт). Бул күтүлбөгөн жыйынтыктар MNA фибробласттардан же шишиктерден TMEдеги коңшу Т-клеткаларга бөлүнүп чыгышы мүмкүн экенин көрсөтүп турат.
Талапкерлерге эрүүчү ташуучу 22 (SLC22) үй-бүлөсү (SLC22A1, SLC22A2 жана SLC22A3) тарабынан коддолгон 1ден 3кө чейинки органикалык катион ташуучуларынын үй-бүлөсү (OCT1, OCT2 жана OCT3) киргени менен, MNAнын потенциалдуу ташуучулары дагы эле аныктала элек (28). Дени сак донор Т-клеткаларынан алынган мРНКнын QPCR анализи SLC22A1 экспрессиясынын төмөн деңгээлин көрсөттү, бирок SLC22A2 деңгээли аныкталбай калды, бул анын мурда адабиятта кабарланганын тастыктады (3F-сүрөт) (29). Ал эми SK-OV-3 энелик бездин шишигинин клетка линиясы эки ташуучунун тең жогорку деңгээлин билдирген (3F-сүрөт).
Т-клеткалардын бөтөн MNAны сиңирүү мүмкүнчүлүгүн текшерүү үчүн, дени сак донордук Т-клеткалар MNAнын ар кандай концентрацияларынын катышуусунда 72 саат бою өстүрүлдү. Экзогендик MNA жок болгондо, MNAнын клеткалык курамын аныктоо мүмкүн эмес (3G-сүрөт). Бирок, экзогендик MNA менен дарыланган активдештирилген Т-клеткалар клеткалардагы MNAнын курамынын дозага көз каранды көбөйүшүн, 6 мМ MNAга чейин көрсөттү (3G-сүрөт). Бул жыйынтык ташуучунун экспрессиясынын төмөн деңгээлине жана клетка ичиндеги MNA метаболизми үчүн жооптуу негизги ферменттин жоктугуна карабастан, TIL дагы эле MNAны сиңире аларын көрсөтүп турат.
Бейтаптардын Т-клеткаларындагы метаболиттердин спектри жана in vitro MNA сиңирүү эксперименттери рак менен байланышкан фибробласттардын (CAF) MNA бөлүп чыгаруу мүмкүнчүлүгүн жогорулатат жана шишик клеткалары TILдин фенотипин жана функциясын жөнгө салышы мүмкүн. MNAнын Т-клеткаларына тийгизген таасирин аныктоо үчүн, дени сак донордук Т-клеткалар in vitro шартында MNA бар же жок болгон учурда активдештирилген жана алардын көбөйүшү жана цитокиндердин өндүрүлүшү бааланган. MNAны эң жогорку дозада кошкондон 7 күн өткөндөн кийин, популяциянын эки эселенген саны орточо түрдө азайган, ал эми бардык дозаларда күч сакталган (4A-сүрөт). Мындан тышкары, экзогендик MNAны дарылоо шишик некрозунун фактору-α экспрессиялаган CD4+ жана CD8+ Т-клеткаларынын үлүшүнүн жогорулашына алып келген (TNFα; 4B-сүрөт). Ал эми, IFN-γ клетка ичиндеги өндүрүшү CD4+ Т-клеткаларында бир кыйла азайган, бирок CD8+ Т-клеткаларында эмес, жана интерлейкин 2де (IL-2; 4-сүрөт, C жана D) олуттуу өзгөрүү болгон эмес. Ошондуктан, бул MNA менен дарыланган Т-клетка культураларынан алынган супернатанттардын ферменттик иммуносорбенттик анализи (ELISA) TNFαнын олуттуу жогорулашын, IFN-γнин төмөндөшүн жана IL-2де эч кандай өзгөрүү болбогонун көрсөттү (4-сүрөт, Eден Gге чейин). . IFN-γнин төмөндөшү MNA Т-клеткалардын шишикке каршы активдүүлүгүн басууда роль ойношу мүмкүн экенин көрсөтүп турат. MNAнын Т-клеткалар аркылуу цитотоксикалык таасирин симуляциялоо үчүн, жашыл флуоресценттик белок (GFP) -CAR-T) клеткалары менен жөнгө салынган фолий рецептору α жана CAR-T (GFP) багытталган химердик антиген рецептору T (FRα-CAR-T) клеткалары дени сак донордук перифериялык кандын мононуклеардык клеткалары (PBMC) тарабынан өндүрүлөт. CAR-T клеткалары MNAнын катышуусунда 24 саат бою өстүрүлүп, андан кийин эффектордун максатка 10:1 катышында фолий рецептору α экспрессиялаган адамдын SK-OV-3 энелик бездин шишик клеткалары менен бирге өстүрүлдү. MNA менен дарылоо FRα-CAR-T клеткаларынын өлтүрүүчү активдүүлүгүнүн олуттуу төмөндөшүнө алып келди, бул аденозин менен дарыланган FRα-CAR-T клеткаларына окшош болгон (4H-сүрөт).
(A) 7-күнү түздөн-түз культурадан алынган жалпы тирүү клеткалардын саны жана популяциянын эки эселениши (PD). Тилкелүү диаграмма алты дени сак донордун орточо маанисин + SEMди билдирет. Жок дегенде n = 3 көз карандысыз эксперименттердин маалыматтарын билдирет. (B дан D га чейин) CD3/CD28 жана IL-2 Т клеткаларын тиешелүү MNA концентрацияларында 7 күн бою активдештирүү үчүн колдонулган. Анализден мурун клеткалар GolgiStop менен PMA/ионимицин менен 4 саат бою стимулдаштырылган. T клеткаларындагы TNFα (B) экспрессиясы. Тирүү клеткалардагы TNFα экспрессиясынын үлгү сүрөтү (солдо) жана таблицалык маалыматтар (оңдо). Т клеткаларындагы IFN-γ (C) жана IL-2 (D) экспрессиясы. Цитокиндердин экспрессиясы агым цитометриясы менен өлчөнгөн. Тилкелүү диаграмма орточо маанини (n = 6 дени сак донор) + SEMди билдирет. P маанисин аныктоо үчүн дисперсиянын бир тараптуу анализин жана кайталанган өлчөөлөрдү (*P<0.05 жана **P<0.01) колдонуңуз. Жок дегенде n = 3 көз карандысыз эксперименттердин маалыматтарын билдирет. (Eден Gге чейин) CD3/CD28 жана IL-2 Т клеткаларын тиешелүү MNA концентрацияларында 7 күн бою активдештирүү үчүн колдонулган. Орточо PMA/ионимицин менен стимуляциялоонун 4 саатынан мурун жана кийин чогултулган. TNFα (E), IFN-γ (F) жана IL-2 (G) концентрациялары ELISA аркылуу өлчөнгөн. Тилкелүү график орточо маанини (n = 5 дени сак донор) + SEMди билдирет. P мааниси дисперсиянын бир тараптуу анализи жана кайталанган өлчөөлөр аркылуу аныкталган (*P<0.05). Нукура сызык аныктоонун аныктоо чегин көрсөтөт. (H) Клетканын лизис анализи. FRα-CAR-T же GFP-CAR-T клеткалары 24 саат бою аденозин (250μM) же MNA (10 mM) менен туураланган же дарыланбай калган (Ctrl). SK-OV-3 клеткаларынын өлтүрүү пайызы өлчөнгөн. P мааниси Welch t тести менен аныкталган (*P<0.5 жана **P<0.01).
MNAга көз каранды TNFα экспрессиясын жөнгө салууну механикалык жактан түшүнүү үчүн, MNA менен дарыланган Т клеткаларынын TNFα мРНКсындагы өзгөрүүлөр бааланган (5A-сүрөт). MNA менен дарыланган дени сак донор Т клеткаларында TNFα транскрипция деңгээли эки эсеге жогорулаган, бул MNAнын TNFα транскрипциялык жөнгө салуусуна көз каранды экенин көрсөтүп турат. Бул мүмкүн болгон жөнгө салуу механизмин изилдөө үчүн, TNFαны жөнгө салуучу эки белгилүү транскрипция фактору, атап айтканда, активдештирилген Т клеткасынын ядролук фактору (NFAT) жана спецификалык белок 1 (Sp1), MNAнын проксималдык TNFα промоторуна байланышына жооп катары бааланган (30). TNFα промоторунда 6 аныкталган NFAT байланыш сайты жана 2 Sp1 байланыш сайты бар, алар бир жерде дал келет [-55 базалык жуп (bp) 5'капкактан] (30). Хроматин иммунопреципитациясы (ChIP) MNA менен дарыланганда, Sp1дин TNFα промоторуна байланышы үч эсеге жогорулаганын көрсөттү. NFATтын кошулушу да жогорулап, маанисине жакындады (5B-сүрөт). Бул маалыматтар MNA TNFα экспрессиясын Sp1 транскрипциясы аркылуу жана азыраак деңгээлде NFAT экспрессиясын жөнгө салаарын көрсөтүп турат.
(A) MNAсыз өстүрүлгөн Т-клеткалар менен салыштырганда, MNA менен дарыланган Т-клеткаларындагы TNFα экспрессиясынын бүктөмдүк өзгөрүшү. SEM менен экспрессиянын схемасы көрсөтүлгөн (n = 5 дени сак донор). Жок дегенде n = 3 көз карандысыз эксперименттердин маалыматтарын билдирет. (B) NFAT жана Sp1ден кийин 8 мМ MNA менен же ансыз дарыланган Т-клеткаларынын TNFα промотору (Ctrl) жана PMA/иономицин менен 4 саат бою айкалышкан. Иммуноглобулин G (IgG) жана H3 иммунопреципитация үчүн тиешелүүлүгүнө жараша терс жана оң контролдук топтор катары колдонулган. ChIPтин сандык баалоосу MNA менен дарыланган клеткаларда Sp1 жана NFATтын TNFα промоторуна байланышы контролдук топко салыштырмалуу бир нече эсе жогорулаганын көрсөттү. Жок дегенде n = 3 көз карандысыз эксперименттердин маалыматтарын билдирет. Бир нече t-тесттери менен аныкталган P мааниси (*** P <0.01). (C) HGSC асциттери менен салыштырганда, Т-клеткалар (цитотоксикалык эмес) шишиктеги TNF экспрессиясынын жогорулаганын көрсөттү. Түстөр ар кандай бейтаптарды билдирет. Көрсөтүлгөн клеткалар кокустук түрдө 300гө чейин үлгү алынып, ашыкча тартууну чектөө үчүн диртилдеп берилген (** Padj = 0.0076). (D) Энелик бездин рагы үчүн сунушталган MNA модели. MNA шишик клеткаларында жана фибробласттарда TMEде өндүрүлөт жана Т клеткалары тарабынан кабыл алынат. MNA Sp1дин TNFα промоторуна байланышын күчөтөт, бул TNFα транскрипциясынын жана TNFα цитокиндеринин өндүрүлүшүнүн жогорулашына алып келет. MNA ошондой эле IFN-γнин төмөндөшүнө алып келет. Т клеткасынын функциясынын басаңдашы өлтүрүү жөндөмүнүн төмөндөшүнө жана шишиктин өсүшүнүн тездешине алып келет.
Маалыматтарга ылайык, TNFα алдыңкы жана арткы көз каранды шишикке каршы жана шишикке каршы таасирге ээ, бирок ал энелик бездин рагынын өсүшүн жана метастазын стимулдаштырууда белгилүү роль ойнойт (31-33). Маалыматтарга ылайык, энелик бездин рагы менен ооругандардын асцит жана шишик ткандарындагы TNFα концентрациясы залалсыз ткандарга караганда жогору (34-36). Механизми жагынан алганда, TNFα лейкоциттердин активдешүүсүн, функциясын жана көбөйүшүн жөнгө салып, рак клеткаларынын фенотипин өзгөртө алат (37, 38). Бул жыйынтыктарга ылайык, дифференциалдык ген экспрессиясын талдоо көрсөткөндөй, TNF шишик ткандарындагы Т клеткаларында асцитке салыштырмалуу бир кыйла жогорулаган (5C-сүрөт). TNF экспрессиясынын жогорулашы цитотоксикалык эмес фенотипке ээ Т клеткаларынын популяцияларында гана байкалган (S5A-сүрөт). Кыскача айтканда, бул маалыматтар MNA HGSCде кош иммуносупрессивдүү жана шишикти стимулдаштыруучу таасирге ээ деген көз карашты колдойт.
Агым цитометриясына негизделген флуоресценттик маркировкалоо TIL метаболизмин изилдөөнүн негизги ыкмасы болуп калды. Бул изилдөөлөр перифериялык кан лимфоциттери же экинчилик лимфоиддик органдардан алынган Т-клеткалар менен салыштырганда, чычкандардын жана адамдын TIL глюкозаны сиңирүүгө көбүрөөк ыктаарын (4, 39) жана митохондриялык функциянын акырындык менен жоголушун (19, 40) көрсөттү. Бул изилдөөдө окшош натыйжаларды байкаганыбыз менен, негизги өнүгүү - шишик клеткаларынын метаболизмин жана ошол эле резекцияланган шишик тканынан алынган TILди салыштыруу. Мурунку отчеттордун айрымдарына ылайык, асциттен жана шишиктерден алынган шишик (CD45-EpCAM +) клеткалары CD8 + жана CD4 + Т клеткаларына караганда глюкозаны көбүрөөк сиңиришет, бул шишик клеткаларынын глюкозаны көп сиңирүүсүн Т клеткалары менен салыштырууга болорун тастыктайт. Т-клеткалардын атаандаштыгы түшүнүгү. TME. Бирок, шишик клеткаларынын митохондриялык активдүүлүгү CD8 + Т клеткаларына караганда жогору, бирок митохондриялык активдүүлүк CD4 + Т клеткаларына окшош. Бул жыйынтыктар кычкылдануу метаболизми шишик клеткалары үчүн маанилүү деген жаңы теманы бекемдейт (41, 42). Алар ошондой эле CD8 + Т клеткалары CD4 + Т клеткаларына караганда кычкылдануу дисфункциясына көбүрөөк дуушар болушу мүмкүн же CD4 + Т клеткалары митохондриялык активдүүлүктү сактоо үчүн глюкозадан башка көмүртек булактарын колдонушу мүмкүн деп божомолдошот (43, 44). Белгилей кетүүчү нерсе, биз асциттеги CD4 + Т эффекторлорунун, Т эффекторунун эс тутумунун жана Т борбордук эс тутум клеткаларынын ортосунда глюкозанын сиңирилишинде же митохондриялык активдүүлүктө эч кандай айырмачылыкты байкаган жокпуз. Ошо сыяктуу эле, шишиктердеги CD8 + Т клеткаларынын дифференциация абалы глюкозанын сиңирилишиндеги өзгөрүүлөргө эч кандай тиешеси жок, бул in vitro өстүрүлгөн Т клеткалары менен in vivo адамдын TIL ортосундагы олуттуу айырмачылыкты баса белгилейт (22). Бул байкоолор ошондой эле калыс автоматтык клетка популяциясын бөлүштүрүү менен тастыкталды, бул андан ары шишик клеткаларына караганда глюкозанын сиңирилиши жана митохондриялык активдүүлүгү жогору болгон CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + клеткалары басымдуулук кылаарын, бирок метаболикалык активдүү клетка популяциясына ээ экенин көрсөттү. Бул популяция scRNA-seq анализинде аныкталган миелоиддик супрессор клеткаларынын же плазмацитоиддик дендриттик клеткалардын болжолдуу субпопуляциясын көрсөтүшү мүмкүн. Бул экөө тең адамдын энелик безинин шишиктеринде катталганы менен [45], алар дагы эле бул миелоиддик субпопуляцияны сүрөттөө үчүн кошумча иш-аракеттерди талап кылат.
Агым цитометриясына негизделген ыкмалар клетка түрлөрүнүн ортосундагы глюкоза жана кычкылдануу метаболизминдеги жалпы айырмачылыктарды тактай алса да, TMEдеги митохондриялык метаболизм үчүн глюкоза же башка көмүртек булактары тарабынан өндүрүлгөн так метаболиттер азырынча аныктала элек. Берилген TIL субтопчосуна метаболиттердин бар же жок экендигин дайындоо үчүн клетка популяциясын кесилген ткандан тазалоо талап кылынат. Ошондуктан, биздин клеткаларды байытуу ыкмабыз массалык спектрометрия менен айкалышып, дал келген пациенттердин үлгүлөрүндөгү Т клеткаларында жана шишик клеткаларынын популяцияларында ар кандай байытылган метаболиттер жөнүндө түшүнүк бере алат. Бул ыкманын флуоресценция менен активдештирилген клеткаларды сорттоого караганда артыкчылыктары болгону менен, айрым метаболит китепканаларына туруктуулук жана/же тез алмашуу ылдамдыгынан улам таасир этиши мүмкүн (22). Ошого карабастан, биздин ыкма эки таанылган иммуносупрессивдүү метаболиттерди, аденозинди жана кинуренинди аныктай алды, анткени алар үлгү түрлөрүнүн ортосунда абдан айырмаланат.
Шишиктердин жана TIL субтиптеринин метабономикалык анализи энелик бездин TMEсиндеги метаболиттердин ролу жөнүндө көбүрөөк маалымат берет. Биринчиден, агым цитометриясын колдонуп, биз шишиктер менен CD4 + T клеткаларынын ортосунда митохондриялык активдүүлүктө эч кандай айырмачылык жок экенин аныктадык. Бирок, LC-MS/MS анализи бул популяциялардын арасында метаболиттердин көптүгүндө олуттуу өзгөрүүлөрдү көрсөттү, бул TIL метаболизми жана анын жалпы метаболикалык активдүүлүгү жөнүндөгү тыянактарды кылдат чечмелөөнү талап кылаарын көрсөтүп турат. Экинчиден, MNA - бул шишиктер эмес, асциттеги CD45-клеткалар менен Т клеткаларынын ортосундагы эң чоң айырмачылыкка ээ метаболит. Ошондуктан, бөлүнүү жана шишиктин жайгашуусу TIL метаболизмине ар кандай таасир этиши мүмкүн, бул белгилүү бир микрочөйрөдөгү мүмкүн болгон гетерогендүүлүктү баса белгилейт. Үчүнчүдөн, MNA өндүрүүчү NNMT ферментинин экспрессиясы негизинен CAF менен чектелет, ал азыраак деңгээлде шишик клеткалары, бирок шишиктен алынган Т клеткаларында MNA деңгээли байкалат. Энелик бездин CAFсиндеги NNMTнин ашыкча экспрессиясы рактын пайда болушуна өбөлгө түзүүчү белгилүү таасирге ээ, бул жарым-жартылай CAF метаболизминин, шишиктин инвазиясынын жана метастаздын күчөшүнө байланыштуу (27). TILдин жалпы деңгээли орточо болгону менен, CAFдеги NNMT экспрессиясы начар прогноз менен байланышкан Рак геномунун атласынын (TCGA) мезенхималык түрүнө тыгыз байланыштуу (27, 46, 47). Акырында, MNAнын деградациясына жооптуу AOX1 ферментинин экспрессиясы CAF популяциясы менен гана чектелет, бул Т клеткаларынын MNAны метаболизмге жөндөмдүү эместигин көрсөтүп турат. Бул жыйынтыктар бул ачылышты текшерүү үчүн андан ары изилдөө керек болсо да, Т клеткаларындагы MNAнын жогорку деңгээли иммуносупрессивдүү CAF микрочөйрөсүнүн бар экендигин көрсөтүшү мүмкүн деген ойду колдойт.
MNA ташуучуларынын экспрессия деңгээлинин төмөндүгүн жана MNA метаболизмине катышкан негизги белоктордун аныкталбаган деңгээлин эске алганда, Т-клеткаларында MNAнын болушу күтүлбөгөн нерсе. NNMT да, AOX1 да scRNA-seq анализи жана эки көз карандысыз когортанын максаттуу qPCR аркылуу аныктала алган жок. Бул жыйынтыктар MNA Т-клеткалар тарабынан синтезделбей турганын, бирок айланадагы TMEден сиңип кетерин көрсөтүп турат. In vitro эксперименттери Т-клеткалар экзогендик MNAны топтоого жакын экенин көрсөтөт.
Биздин in vitro изилдөөлөрүбүз көрсөткөндөй, экзогендик MNA Т клеткаларында TNFα экспрессиясын индукциялайт жана Sp1дин TNFα промоторуна байланышын күчөтөт. TNFα шишикке каршы жана шишикке каршы функцияларга ээ болгону менен, энелик бездин рагында TNFα энелик бездин рагынын өсүшүнө өбөлгө түзө алат (31-33). Энелик бездин шишигинин клеткаларынын культурасында TNFαны нейтралдаштыруу же чычкан моделдеринде TNFα сигналын жок кылуу TNFα аркылуу сезгенүү цитокиндеринин өндүрүлүшүн жакшыртып, шишиктин өсүшүн басаңдатат (32, 35). Ошондуктан, бул учурда TMEден алынган MNA аутокриндик цикл аркылуу TNFαга көз каранды механизм аркылуу сезгенүүнү пайда кылуучу метаболит катары иштей алат, ошону менен энелик бездин рагынын пайда болушуна жана жайылышына өбөлгө түзөт (31). Бул мүмкүнчүлүккө таянып, TNFα блокадасы энелик бездин рагынын потенциалдуу терапиялык агенти катары изилденип жатат (37, 48, 49). Мындан тышкары, MNA CAR-T клеткаларынын энелик бездин шишигинин клеткаларына цитотоксикалык таасирин тийгизип, MNA аркылуу иммундук басуунун кошумча далилдерин берет. Жалпысынан алганда, бул жыйынтыктар шишиктер жана CAF клеткалары MNAны клеткадан тышкаркы TMEге бөлүп чыгарган моделди көрсөтүп турат. (i) TNF тарабынан индукцияланган энелик без рагынын өсүшүн стимулдаштыруу жана (ii) MNA тарабынан индукцияланган Т-клеткалардын цитотоксикалык активдүүлүгүнүн ингибирлениши аркылуу бул кош шишик таасирин тийгизиши мүмкүн (5D-сүрөт).
Жыйынтыктап айтканда, клеткаларды тез байытуунун, бир клеткалуу секвенирлөөнүн жана метаболикалык профилдөөнүн айкалышын колдонуу менен, бул изилдөө HGSC бейтаптарындагы шишиктер менен асцит клеткаларынын ортосундагы чоң иммунометаболомикалык айырмачылыктарды аныктады. Бул комплекстүү анализ Т-клеткалардын ортосунда глюкозанын сиңирилишинде жана митохондриялык активдүүлүктө айырмачылыктар бар экенин көрсөттү жана MNAны клеткалык эмес автономдуу иммундук жөнгө салуучу метаболит катары аныктады. Бул маалыматтар TME адамдын рак ооруларында Т-клеткаларынын метаболизмине кандай таасир этерине таасир этет. Т-клеткалар менен рак клеткаларынын ортосундагы азык заттар үчүн түз атаандаштык жөнүндө кабарланганы менен, метаболиттер шишиктин өнүгүшүн тездетүү жана эндогендик иммундук жоопторду басуу үчүн кыйыр жөнгө салуучу катары да иштей алат. Бул жөнгө салуучу метаболиттердин функционалдык ролун андан ары сүрөттөө шишикке каршы иммундук жоопту күчөтүү үчүн альтернативдүү стратегияларды ачышы мүмкүн.
Бейтаптын үлгүлөрү жана клиникалык маалыматтары Канаданын Ткань Репозиторий Тармагы тарабынан сертификацияланган Британ Колумбиясынын рак шишигинин ткань репозиторийи аркылуу алынган. Британ Колумбиясынын Рак Изилдөө Этикасы Комитети жана Британ Колумбиясы Университети тарабынан бекитилген протоколго ылайык (H07-00463), бардык бейтаптардын үлгүлөрү жана клиникалык маалыматтары жазуу жүзүндө маалымдуу макулдук алган же расмий түрдө макулдугунан баш тарткан. Үлгүлөр сертификацияланган BioBankта (BRC-00290) сакталат. Бейтаптын деталдуу мүнөздөмөлөрү S1 жана S5 таблицаларында көрсөтүлгөн. Криоконсервациялоо үчүн скальпель бейтаптын шишик үлгүсүн механикалык жол менен ажыратуу үчүн колдонулат, андан кийин аны 100 микрондук чыпка аркылуу түртүп, бир клеткалуу суспензияны алат. Бейтаптын асцити клеткаларды майдалап, үстүнкү катмарды алып салуу үчүн 4°C температурада 1500 айн/мин ылдамдыкта 10 мүнөт центрифугаланган. Шишиктен жана асциттен алынган клеткалар 50% жылуулук менен инактивдештирилген адамдын AB сывороткасында (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640та (Thermo Fisher Scientific) жана 10% диметилсульфоксидде криоконсервацияланган. Бул консервацияланган бир клеткалуу суспензиялар эритип, төмөндө баяндалган метаболомика жана метаболиттерди аныктоо үчүн колдонулган.
Толук чөйрө 0,22 мкм чыпкаланган 50:50 кошулган RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2,05 мМ л-глутаминден (Thermo Fisher Scientific) 10% жылуулук менен инактивдештирилген адамдын AB сывороткасы (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific), 1 х пенициллин стрептомицин (PenStrep) эритмеси (Thermo Fisher Scientific) жана 50 мкМ-меркаптоэтанол менен кошулган. AimV (Invitrogen) 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) жана 2 мМ л-глутамин (Thermo Fisher Scientific) менен кошулган. Агым цитометринин боёочу буфери 3% жылуулук менен инактивдештирилген адамдын AB сывороткасы (Sigma) менен кошулган 0,22 мкм чыпкаланган фосфат буферленген туздуу эритмеден (PBS; Invitrogen) турган. Клетканы байытуу буфери 0,22 мкм чыпкаланган PBSтен турат жана 0,5% жылуулук менен инактивдештирилген адамдын AB сывороткасы (Sigma-Aldrich) менен толукталган.
37°C толук чөйрөдө клеткалар 10 нМ MT DR жана 100 μM 2-NBDG менен 30 мүнөт боёлгон. Андан кийин, клеткалар 4°C температурада 15 мүнөт eF506 жашоого жөндөмдүү боёгу менен боёлгон. Клеткаларды FC Block (eBioscience) жана Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) температураларында кайра эритип, агым цитометринин боёо буферинде суюлтуп (өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык), бөлмө температурасында 10 мүнөт инкубациялаңыз. Клеткаларды антителолор топтому менен (S2 таблицасы) 4°C температурада 20 мүнөт боёңуз. Анализден мурун клеткаларды агым цитометриясынын боёо буферинде (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясы) кайра эритип алыңыз. Клеткалардын санынын маалыматтарын талдоо үчүн SpectroFlo жана FlowJo V10 колдонуңуз, ал эми маалыматтарды түзүү үчүн GraphPad Prism 8 колдонуңуз. 2-NBDG жана MT DR медианасы флуоресценция интенсивдүүлүгү (MFI) логарифмдик нормалдаштырылган, андан кийин дал келген бейтаптарды эсепке алуу үчүн статистикалык анализ үчүн жупташкан t-тест колдонулган. Анализден 40тан аз окуясы бар бардык популяцияларды алып салыңыз; статистикалык анализди жана маалыматтарды визуализациялоону жүргүзүүдөн мурун, терс маанилер үчүн 1 MFI маанисин киргизиңиз.
Жогорудагы процесстик панелдин кол менен дарбазалоо стратегиясын толуктоо үчүн, биз FlowJoдогу өлгөн клеткаларды жок кылгандан кийин популяцияга клеткаларды автоматтык түрдө дайындоо үчүн форманы чектөө дарагынын (FAUST) (21) толук аннотациясын колдондук. Туура эмес бөлүштүрүлгөндөй көрүнгөн (PD1+ менен PD1-шишик клеткаларын айкалыштыруу) жана сакталып калган популяцияларды бириктирүү үчүн биз чыгарууну кол менен башкарабыз. Ар бир үлгүдө орточо эсеп менен 2% дан ашык клеткалар бар, жалпысынан 11 популяция.
PBMCди лейкоциттерди бөлүү продуктуларынан (STEMCELL Technologies) бөлүү үчүн Фиколл градиентинин тыгыздык центрифугасы колдонулган. CD8 + Т клеткалары PBMCден CD8 MicroBeads (Miltenyi) колдонуп бөлүнүп алынып, өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык TransAct (Miltenyi) колдонуп толук чөйрөдө 2 жума бою кеңейтилген. Клеткалар IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) камтыган толук чөйрөдө 5 күн тыныктырып, андан кийин TransAct менен кайрадан стимулдаштырылган. 7-күнү, өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык, клеткаларды байытуу үчүн үч жолу катары менен адамдын CD45 MicroBeads (Miltenyi) колдонулган. Клеткалар агым цитометриясын анализдөө үчүн (жогоруда сүрөттөлгөндөй) бөлүнүп алынган жана бир миллион клетка LC-MS/MS анализи үчүн үч жолу бөлүнгөн. Үлгүлөр төмөндө сүрөттөлгөндөй LC-MS/MS менен иштетилген. Биз жок метаболиттин маанисин 1000 ион саны менен баалаганбыз. Ар бир үлгү жалпы ион саны (ЖИС) менен нормалдашат, логарифмдик түрдө өзгөртүлөт жана анализ жүргүзүүдөн мурун MetaboAnalystR программасында автоматтык түрдө нормалдашат.
Ар бир бейтаптын бир клеткалуу суспензиясы эритип, 40 мкм чыпка аркылуу толук чөйрөгө чыпкаланган (жогоруда сүрөттөлгөндөй). Өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык, CD8+, CD4+ жана CD45-клеткалары үчүн үлгүлөрдү байытуу үчүн (музда) MicroBeads (Miltenyi) колдонуу менен магниттик мончокторду бөлүү аркылуу үч жолу катары менен оң тандоо жүргүзүлдү. Кыскасы, клеткалар клетканы байытуу буферинде кайра эритилип (жогоруда сүрөттөлгөндөй) эсептелет. Клеткалар адамдын CD8 мончоктору, адамдын CD4 мончоктору же адамдын CD45 мончоктору (Miltenyi) менен 4°C температурада 15 мүнөт инкубацияланып, андан кийин клетканы байытуу буфери менен жуулган. Үлгү LS тилкесинен (Miltenyi) өткөрүлүп, оң жана терс фракциялар чогултулат. Узактыгын кыскартуу жана клетканы калыбына келтирүү кадамын максималдаштыруу үчүн, андан кийин CD8-фракциясы CD4+ байытуунун экинчи айлампасы үчүн, ал эми CD4-фракциясы кийинки CD45 байытуу үчүн колдонулат. Бөлүү процессинде эритмени музда кармаңыз.
Метаболиттерди анализдөө үчүн үлгүлөрдү даярдоо үчүн клеткалар муздак туз эритмеси менен бир жолу жуулуп, ар бир үлгүгө 1 мл 80% метанол кошулуп, андан кийин аралаштырылып, суюк азотто тоңдурулган. Үлгүлөр үч тоңдуруу-эритүү циклине дуушар болуп, 4°C температурада 15 мүнөт бою 14 000 айн/мин ылдамдыкта центрифугаланган. Метаболиттерди камтыган үстүнкү катмар кургаганга чейин бууланат. Метаболиттер 50 мкл 0,03% кумурска кислотасында кайра эритилип, аралаштырылып, андан кийин калдыктарды кетирүү үчүн центрифугаланган.
Метаболиттерди жогоруда сүрөттөлгөндөй бөлүп алыңыз. Метаболомиканы изилдөө үчүн үстүнкү катмарды жогорку натыйжалуу суюк хроматография бөтөлкөгө которуңуз. Партиялык таасирлердин алдын алуу үчүн ар бир үлгүнү окшош сандагы клеткалар менен иштетүү үчүн кокустук дарылоо протоколун колдонуңуз. Биз мурда AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) сайтында жарыяланган глобалдык метаболиттерди сапаттык баалоону жүргүздүк. Хроматографиялык анализ жана чоку аянтын интеграциялоо MultiQuant версиясынын 2.1 программасын (Applied Biosystems SCIEX) колдонуу менен жүргүзүлдү.
Жок метаболиттин маанисин баалоо үчүн 1000 ион саны колдонулган, ал эми ар бир үлгүнүн TICи үлгүнү иштетүүдөн инструменталдык анализ аркылуу киргизилген өзгөрүүлөрдү оңдоо үчүн ар бир аныкталган метаболиттин нормалдаштырылган чоку аянтын эсептөө үчүн колдонулган. TIC нормалдаштырылгандан кийин, логарифмдик конвертациялоо жана автоматтык норма сызыгын масштабдоо үчүн MetaboAnalystR(51) (демейки параметр) колдонулат. Биз үлгү түрлөрүнүн ортосундагы метаболомдук айырмачылыктарды изилдөө анализин жүргүзүү үчүн вегетариандык R пакети менен PCA колдондук жана бейтаптарды талдоо үчүн жарым-жартылай ашыкча анализ колдондук. Үлгүлөрдүн ортосундагы Евклиддик аралыкты кластерлөө үчүн жылуулук картасынын дендрограммасын түзүү үчүн Уорд ыкмасын колдондук. Бүт клетка түрү жана микрочөйрө боюнча ар кандай мол метаболиттерди аныктоо үчүн стандартташтырылган метаболиттердин көптүгү боюнча limma (52) колдондук. Түшүндүрмөнү жөнөкөйлөтүү үчүн, биз моделди көрсөтүү үчүн топтук орточо параметрди колдонобуз жана микрочөйрөдөгү клетка түрлөрүн ар бир топ катары карайбыз (n = 6 топ); Маанилүүлүк тести үчүн биз ар бир метаболит үчүн үч жолу кайталап өлчөө жүргүздүк. Жалган репликациядан качуу үчүн, бейтап лимманын дизайнында тоскоолдук катары киргизилген. Ар кандай бейтаптардын ортосундагы метаболиттердин айырмачылыктарын текшерүү үчүн, биз бейтаптарды камтыган лимма моделин белгиленген жол менен туураладык. Биз клетканын түрү менен Padj <0.05 микрочөйрөсүнүн ортосундагы алдын ала аныкталган контрасттын маанисин билдиребиз (Бенджамини-Хохбергдин коррекциясы).
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% жашоого жөндөмдүүлүк) менен байытылгандан кийин, жалпы тирүү тоңдурулган асцит жана шишик үлгүлөрүндө 10x 5'ген экспрессиясынын протоколун колдонуу менен бир клеткалуу транскриптомдук секвенирлөө жүргүзүлдү. Бир шишик үлгүсүнөн алынган жашоого жөндөмдүүлүктүн төмөндүгү аны кошууга тоскоол болгонуна карабастан, дал келген шишиктер жана асциттер менен беш учур талданды. Бейтаптарды бир нече жолу тандоо үчүн, биз ар бир бейтаптын үлгүлөрүн 10x хром контроллеринин тилкелерине бириктирип, асцит менен шишик жерлерин өзүнчө талдадык. Ырааттуулукту аныктоодон кийин [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp жупташкан учу (PE), Квебек геному; Шишик жана асцит үчүн клеткага орточо эсеп менен 73 488 жана 41 378 окуу]], биз CellSNP жана Vireo (53) колдондук (CellSNP негизинде). GRCh38 тарабынан берилген жалпы адамдын SNP (VCF) донордун идентификациясы дайындалат. Биз бейтаптын генотип статусунун (IBS) эң жакын идентификациясын (IBS) аныктоо үчүн SNPRelate колдонобуз, дайындалбаган клеткаларды жана дуплекс катары аныкталган клеткаларды жана асцит менен шишик үлгүлөрүнүн ортосундагы донорлорду дал келтирбейбиз (54). Бул тапшырманын негизинде, биз шишик жана асцитте клеткалардын көп чагылдырылышы бар үч учурду кийинки анализ үчүн сактап калдык. Скатердеги (55) жана скрандагы (56) BioConductor таңгагында массалык чыпкалоо кадамын аткаргандан кийин, анализ үчүн 6975 клетка (шишиктен жана асциттен тиешелүүлүгүнө жараша 2792 жана 4183 клетка) алынды. Биз Жаккарддын аралыгына негизделген igraphтын (57) Лувендин жалпы жакын кошуна тармагынын (SNN) кластерин колдонобуз. экспрессиясы боюнча кластердик клеткалар. Кластерлер маркердик ген экспрессиясына негизделген болжолдуу клетка түрлөрүнө кол менен аннотацияланган жана t-SNE менен визуалдаштырылган. Цитотоксикалык Т-клеткалар CD8A жана GZMA экспрессиясы менен аныкталат, рибосомалык белок экспрессиясы төмөн субкластерлерди кошпогондо. Биз Изар жана башкалардын жарыяланган маалыматтарына (16) кайрылдык, анын ичинде алардын t-SNE киргизилиши иммундук клетка маркерлери менен NNMT экспрессиясынын ортосундагы экспрессиянын дал келүүсүн башкара алат.
ПБМК лейкоциттерди бөлүү продуктуларынан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тыгыздык центрифугалоо жолу менен бөлүнгөн. CD3+ клеткалары ПБМКдан CD3 мончоктору (Miltenyi) аркылуу бөлүнүп алынган. MNA бар же жок болгон учурда, CD3+ клеткалары пластина менен байланышкан CD3 (5 мкг/мл), эрүүчү CD28 (3 мкг/мл) жана IL-2 (300 U/мл; Пролейкин) менен активдештирилген. Кеңейүүнүн акыркы күнүндө жашоого жөндөмдүүлүгү (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) жана пролиферациясы (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) агым цитометриясы аркылуу бааланган. PMA (20 нг/мл) жана ионимицин (1 мкг/мл) менен GolgiStop менен 4 саат бою клеткаларды стимулдаштыруу жана CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) жана TNFα-флуоресцеин изотиоцианатын (FITC) (MAb11, BD) көзөмөлдөө аркылуу эффектордук функцияны баалоо. qPCR жана ChIP клеткаларын PMA (20 нг/мл) жана ионимицин (1 мкг/мл) менен 4 саат бою стимулдаштыруу. ELISA супернатаны PMA (20 нг/мл) жана ионимицин (1 мкг/мл) менен стимуляциялоодон мурун жана кийин 4 саат бою чогултулган.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) колдонуп, РНКны бөлүп алуу үчүн өндүрүүчүнүн протоколун аткарыңыз. Үлгүнү гомогендештирүү үчүн QIAshredder (QIAGEN) колдонуңуз. Комплементардуу ДНКны (cDNA) синтездөө үчүн жогорку кубаттуулуктагы РНКны cDNAга айландыруу комплектин (Thermo Fisher Scientific) колдонуңуз. Төмөнкү зонддор менен ген экспрессиясын сандык жактан аныктоо үчүн (өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык) TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) колдонуңуз: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [гидрогенсиз глицералдегид-3-фосфат (GAPDH)] жана Hs01010726_m1 (SLC22A2). Үлгүлөр MicroAmp оптикалык пленкасы бар MicroAmp тез оптикалык 96 кудуктуу реакция пластинасындагы (Applied Biosystems) StepOnePlus реалдуу убакыттагы ПЦР системасында (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) иштетилди. 35тен ашкан ар кандай Ct мааниси аныктоо босогосунан жогору деп эсептелет жана аныкталбайт деп белгиленет.
ChIPди мурда сүрөттөлгөндөй (58) аткарыңыз. Кыскасы, клеткалар формальдегид менен иштетилип (акыркы концентрациясы 1,42%), бөлмө температурасында 10 мүнөт инкубацияланган. Кошумча шишик буферин (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl жана 0,1% NP-40) музда 10 мүнөт колдонуңуз, андан кийин сүрөттөлгөндөй (58) иммунопреципитация буферинде кайра эритиңиз. Андан кийин үлгү төмөнкү циклдер менен ультраүн менен иштетилген: 10 цикл (20 1 секунддук импульс) жана 40 секунддук статикалык убакыт. ChIP даражасындагы иммуноглобулин G (клетка сигнализация технологиясы; 1 мкл), гистон H3 (клетка сигнализация технологиясы; 3 мкл), NFAT (Invitrogen; 3 мкл) жана SP1 (клетка сигнализация технологиясы; 3 мкл) антителолорун үлгү менен 4°CC температурада түнү бою чайкап инкубациялаңыз. А протеининин мончокторун (Thermo Fisher Scientific) үлгү менен 4°C температурада 1 саат бою акырын чайкап инкубациялаңыз, андан кийин ДНКны байытуу үчүн хелекс мончокторун (Bio-Rad) колдонуңуз жана белокту сиңирүү үчүн протеиназа К (Thermo Fisher) колдонуңуз. ПТР аркылуу TNFα промотору аныкталды: түз, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; тескерисинче, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp продукт). Сүрөттөр Image Lab (Bio-Rad) тарабынан тартылып, ImageJ программасын колдонуу менен сандык жактан аныкталган.
Клетка культурасынын үстүнкү катмары жогоруда сүрөттөлгөндөй чогултулган. Аныктоо адамдын TNFα ELISA комплекти (Invitrogen), адамдын IL-2 ELISA комплекти (Invitrogen) жана адамдын IFN-γ ELISA комплекти (Abcam) боюнча өндүрүүчүнүн жол-жоболоруна ылайык жүргүзүлдү. Өндүрүүчүнүн протоколуна ылайык, үстүнкү катмар TNFα жана IL-2 аныктоо үчүн 1:100, ал эми IFN-γ аныктоо үчүн 1:3 катышында суюлтулган. 450 нмдеги абсорбцияны өлчөө үчүн EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) колдонуңуз.
ПБМК лейкоциттерди бөлүү продуктуларынан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент тыгыздык центрифугалоо жолу менен бөлүнгөн. CD3+ клеткалары ПБМКдан CD3 мончоктору (Miltenyi) аркылуу бөлүнүп алынган. MNA бар же жок болгон учурда, CD3+ клеткалары пластинага байланган CD3 (5 мкг/мл), эрүүчү CD28 (3 мкг/мл) жана IL-2 (300 U/мл; Пролейкин) менен 3 күн бою активдештирилген. 3 күндөн кийин клеткалар чогултулуп, 0,9% туздуу эритме менен жуулган, ал эми гранула тез тоңдурулган. Клеткаларды саноо 123count eBeads колдонуу менен агым цитометриясы (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигурациясы) аркылуу жүргүзүлдү.
Жогоруда сүрөттөлгөндөй метаболиттерди экстракттоо. Кургатылган экстракт 4000 клетка эквиваленти/мкл концентрациясында калыбына келтирилген. Үлгүнү тескери фазалуу хроматография (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) жана CORTECS T3 мамычасы (2.1×150 мм, бөлүкчөлөрдүн өлчөмү 1.6-мкм, тешикчелердин өлчөмү 120-Å; #186008500, Уотерс) аркылуу талдаңыз. Полярдык массалык спектрометр (6470, Agilent), анда электроспрей иондоштуруу оң режимде иштейт. Мобилдик А фазасы 0.1% кумурска кислотасынан (H2Oдо), кыймылдуу В фазасы 90% ацетонитрилден, 0.1% кумурска кислотасынан турат. LC градиенти 100% A үчүн 0дон 2 мүнөткө чейин, 99% B үчүн 2ден 7,1 мүнөткө чейин жана 99% B үчүн 7,1ден 8 мүнөткө чейин. Андан кийин тилкени 0,6 мл/мин агым ылдамдыгында 3 мүнөт бою кыймылдуу А фазасы менен кайра тең салмактаңыз. Агым ылдамдыгы 0,4 мл/мин, ал эми тилке камерасы 50°C чейин ысытылат. Кармоо убактысын (RT) жана трансформацияны (RT = 0,882 мүнөт, 1-трансформация = 137→94,1, 2-трансформация = 137→92, 3-конверсия = 137→78) аныктоо үчүн MNAнын таза химиялык стандартын (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) колдонуңуз. Үч өткөөл тең туура кармоо убактысында болгондо, өзгөчөлүктү камсыз кылуу үчүн 1-өткөөл сандык аныктоо үчүн колдонулат. MNAнын (Toronto Research Chemical Company) стандарттык ийри сызыгы 0,1, 1,0, 10 жана 100 нг/мл жана 1,0 жана 10 мкг/мл суюктук стандарттарын алуу үчүн баштапкы эритмени (1 мг/мл) алты жолу удаалаш суюлтуу менен түзүлгөн. Аныктоо чеги 1 нг/мл, ал эми сызыктуу жооп 10 нг/мл жана 10 мкг/мл ортосунда. LC/MS анализи үчүн эки микролитр үлгү жана стандарттын ар бир инъекциясы колдонулат жана анализ платформасынын туруктуулугун камсыз кылуу үчүн ар бир сегиз инъекцияда аралаш сапатты көзөмөлдөө үлгүсү жүргүзүлөт. MNA менен иштетилген бардык клетка үлгүлөрүнүн MNA жооптору анализдин сызыктуу диапазонунда болгон. Маалыматтарды талдоо MassHunter сандык анализ программасын (v9.0, Agilent) колдонуу менен жүргүзүлдү.
Экинчи муундагы αFR-CAR конструкциясы Сонг жана башкалардан алынган (59). Кыскасы, конструкция төмөнкү мазмунду камтыйт: CD8a лидерлик ырааттуулугу, адамдын αFRге мүнөздүү бир чынжырлуу өзгөрмө фрагменти, CD8a шарнир жана трансмембраналык аймак, CD27 клетка ичиндеги домен жана CD3z клетка ичиндеги домен. Толук CAR ырааттуулугу GenScript аркылуу синтезделген, андан кийин трансдукциянын натыйжалуулугун баалоо үчүн колдонулган GFP экспрессия кассетасынын жогору жагындагы экинчи муундагы лентивирустук экспрессия векторуна клондолгон.
Лентивирус HEK293T клеткаларын трансфекциялоо жолу менен өндүрүлөт [Америкалык типтеги культуралар жыйнагы (ATCC); 10% түйүлдүк уйдун кан сары суусун (FBS) жана 1% PenStrep камтыган Дулбекконун модификацияланган Eagle чөйрөсүндө өстүрүлөт жана CAR-GFP вектору колдонулат. Таңгактоочу плазмидалар (psPAX2 жана pMD2.G, Addgene) липофекция аминин (Sigma-Aldrich) колдонот. Вирус камтыган супернатант трансфекциядан 48 жана 72 саат өткөндөн кийин чогултулуп, чыпкаланып, ультрацентрифугалоо жолу менен концентрацияланган. Концентрацияланган вирустук супернатант трансдукцияга чейин -80°C температурада сакталат.
PBMC дени сак донордук лейкоциттерди бөлүү продуктуларынан (STEMCELL Technologies) Ficoll градиенттик тыгыздык центрифугалоо жолу менен бөлүнөт. PBMCден CD8+ клеткаларын бөлүп алуу үчүн оң тандоо CD8 микробунун мончокторун (Miltenyi) колдонуңуз. Т-клеткаларды TransAct (Miltenyi) жана TexMACS чөйрөсүндө стимулдаштырыңыз [Miltenyi; 3% жылуулук менен инактивдештирилген адам сывороткасы, 1% PenStrep жана IL-2 (300 U/мл) менен толукталган]. Стимулдаштыруудан жыйырма төрт саат өткөндөн кийин, Т-клеткалар лентивирус (106 клеткага 10 мкл концентрацияланган вирус супернатаны) менен трансдукцияланган. Cytek Auroraда (FSC (Алдыга чачыратуу)/SSC (Каптал чачыратуу), Singlet, GFP+) трансдукциялангандан 1-3 күн өткөндөн кийин, трансдукциянын натыйжалуулугун кеминде 30% көрсөтүү үчүн клеткалардын GFP экспрессиясын баалаңыз.
CAR-T клеткалары Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep кошулган) чөйрөсүндө 24 саат бою төмөнкү шарттарда өстүрүлгөн: иштетилбеген, 250 мкМ аденозин же 10 мМ MNA менен иштетилген. Алдын ала дарылоодон кийин, CAR-T клеткалары PBS менен жуулуп, 10% FBS жана 1% PenStrep кошулган 20 000 SK-OV-3 клеткалары [ATCC; McCoy 5A чөйрөсүндө (Sigma-Aldrich): 10% FBS жана 1% PenStrep кошулган эффектордун максатка катышы кошумча Immunocult чөйрөсүндө үч эсе көбөйтүлгөн. Сандык сапонин (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich) менен лизистелген SK-OV-3 клеткалары жана SK-OV-3 клеткалары тиешелүүлүгүнө жараша терс жана оң контролдук топтор катары колдонулган. 24 сааттык бирге өстүрүүдөн кийин, үстүнкү катмар чогултулуп, лактатдегидрогеназа (LDH) өндүрүүчүнүн көрсөтмөлөрүнө ылайык өлчөнгөн (LDH Glo Cytotoxicity Analysis Kit, Promega). LDH үстүнкү катмары LDH буферинде 1:50 катышында суюлтулган. Өлтүрүү пайызы төмөнкү формула боюнча өлчөнгөн: өлтүрүү пайызы = коррекция пайызы / максималдуу өлтүрүү ылдамдыгы x 100%, мында коррекция пайызы = бирге өстүрүү-Т клеткалары гана, ал эми максималдуу өлтүрүү ылдамдыгы = оң контролдук-терс контролдук.
Текстте же материалдарда жана ыкмаларда сүрөттөлгөндөй, статистикалык анализ үчүн GraphPad Prism 8, Microsoft Excel же R v3.6.0 колдонуңуз. Эгерде бир эле бейтаптан бир нече үлгүлөр чогултулса (мисалы, асцит жана шишик), биз жупташтырылган t-тестти колдонобуз же бейтапты сызыктуу же жалпыланган моделге кокустук эффект катары киргизебиз. Метаболомика анализи үчүн маанилүүлүк тести үч нускада жүргүзүлөт.
Бул макала боюнча кошумча материалдарды http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 дарегинен караңыз.
Бул Creative Commons Attribution-Non-Commercial License шарттары боюнча таратылган ачык жеткиликтүү макала, ал каалаган каражатта колдонууга, таратууга жана көчүрүүгө мүмкүндүк берет, эгерде акыркы колдонуу коммерциялык пайда үчүн болбосо жана түпнуска чыгарма туура болсо. Шилтеме.
Эскертүү: Биз сизден электрондук почта дарегиңизди берүүнү гана суранабыз, ошондо сиз баракчага сунуштаган адам сиз электрондук катты көрүшүн каалаарыңызды жана ал спам эмес экенин билет. Биз эч кандай электрондук почта даректерин кармабайбыз.
Бул суроо сиздин конок экениңизди текшерүү жана спамдын автоматтык түрдө жөнөтүлүшүнүн алдын алуу үчүн колдонулат.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара МакФерсон), Лорен Дж. Захариас (Лорен Г. Захариас), Абигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Бред Х. Нельсон), Ралди (Бред Х. Дж. Р. Дейлар) ДеБерардинис), Рассел Джонс (Рассел Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
MNA Т клеткаларынын иммундук басылышына салым кошот жана адамдын рак оорусун дарылоодо потенциалдуу иммунотерапиянын бутасын билдирет.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара МакФерсон), Лорен Дж. Захариас (Лорен Г. Захариас), Абигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Бред Х. Нельсон), Ралди (Бред Х. Дж. Р. Дейлар) ДеБерардинис), Рассел Джонс (Рассел Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
MNA Т клеткаларынын иммундук басылышына салым кошот жана адамдын рак оорусун дарылоодо потенциалдуу иммунотерапиянын бутасын билдирет.
©2021 Илимди өнүктүрүү боюнча Америка Ассоциациясы. бардык укуктар корголгон. AAAS HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef жана COUNTERдин өнөктөшү. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.